DBP-MBP、DEHP-MEHP影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：鄰苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters，PAEs)暴露所帶來的健康效應(yīng)，尤其是對生殖系統(tǒng)的影響，已成為威脅人類身體健康和子孫后代生存繁衍的重要公共衛(wèi)生問題，PAEs可能通過對睪丸間質(zhì)細(xì)胞中P450scc、3β-HSD、P450c17的作用而影響雄性激素的合成和間質(zhì)細(xì)胞分布的改變，進(jìn)而影響下丘腦-垂體-睪丸軸，同時，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞中存在的胰島素樣因子3(insulin-like factor3，Insl3)的表達(dá)降低，

2、進(jìn)而對睪丸的正常下降產(chǎn)生影響，上述表達(dá)的改變導(dǎo)致一系列發(fā)育障礙。鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)作為污染較嚴(yán)重、暴露水平較高的PAEs，本研究以睪酮合成途徑為切入點，探討DBP及其主要代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單丁酯(monobutyl phthalate，MBP)、DEHP及其主要代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單（2-乙基己基

3、）酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate，MEHP)對小鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞睪酮合成相關(guān)機(jī)制的影響，以期對PAEs生殖毒性的分子機(jī)制進(jìn)行探索，為內(nèi)分泌干擾物對人類潛在影響的研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法1.CCK-8法測定DBP、MBP、DEHP和MEHP對小鼠睪丸間質(zhì)瘤MLTC-1細(xì)胞毒性，確定染毒劑量。體外培養(yǎng)MLTC-1細(xì)胞，分別加入不同濃度梯度的DBP、MBP、DEHP和MEHP作用24h后，以CCK-8

4、法觀察DBP、MBP、DEHP和MEHP對MLTC-1細(xì)胞存活率的影響，并確定染毒劑量。2.直接化學(xué)發(fā)光法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的睪酮水平。體外培養(yǎng)MLTC-1細(xì)胞，分別加入不同濃度梯度的DBP、MBP、DEHP、MEHP，提取培養(yǎng)上清液，在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院的實驗室采用直接化學(xué)發(fā)光法測定睪酮含量，觀察DBP、MBP、DEHP、MEHP對MLTC-1細(xì)胞分泌睪酮水平的影響。3.檢測P450scc、3β-HSD、P450c17、INSL3mR

5、NA的表達(dá)水平。體外培養(yǎng)MLTC-1細(xì)胞，分別以不同濃度的DBP、MBP、DEHP和MEHP作用于細(xì)胞24h后，運用實時熒光定量PCR測定P450scc、3β-HSD、P450c17、INSL3 mRNA表達(dá)水平的變化。4.蛋白免疫印跡法(WesternBlot)檢測INSL3蛋白表達(dá)水平的變化。體外培養(yǎng)MLTC-1細(xì)胞，分別以不同濃度的DBP、MBP、DEHP和MEHP作用于細(xì)胞24h后，進(jìn)行蛋白印跡法(WesternBlot)測定I

6、NSL3蛋白表達(dá)水平的變化。5.流式細(xì)胞術(shù)檢測MLTC-1細(xì)胞凋亡。體外培養(yǎng)MLTC-1細(xì)胞，分別以不同濃度的DBP、MBP、DEHP和MEHP作用24h后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測MLTC-1細(xì)胞凋亡比例的變化情況。
　　 結(jié)果1.DBP、MBP、DEHP和MEHP分別作用24h后，與對照組相比，濃度為2000μmol/L的DBP、MBP組細(xì)胞活性顯著下降(p＜0.05)，濃度為0.001、0.01mol/L的MBP組細(xì)胞活性顯著增

7、加(p＜0.05)，1000、100μmol/L的DEHP、MEHP組細(xì)胞活性顯著降低(p＜0.05)。根據(jù)檢測結(jié)果確定DBP/MBP染毒劑量為:對照組(0μmol/L)、0.1、10、1000μmol/L; DEHP、MEHP染毒劑量為:對照組(0μmol/L)、0.001、0.1、10μmol/L。2.染毒24h后，在人絨毛膜促性腺激素(humanChorionic Gonadotropin，hCG)刺激狀態(tài)下，細(xì)胞合成睪酮的水平均

8、隨著染毒劑量的增加表現(xiàn)為先增加后下降的趨勢，與對照組比較，0.1μmol/L的MBP組睪酮水平明顯升高，1000μmol/L的MBP組睪酮水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);1000μmol/L的DBP組睪酮水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);0.001μmol/L的DEHP組細(xì)胞睪酮水平顯著升高(p＜0.05);10μmol/L的MEHP組細(xì)胞睪酮水平降低，差異有顯著性(p＜0.05)。3.熒光定量PCR結(jié)果表

9、明，DBP、MBP均能抑制P450scc、3β-HSD、P450c17 mRNA表達(dá)，與對照組比較，除了0.1μmol/L的MBP處理組未見統(tǒng)計學(xué)差異，其他各組的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。0.001μmol/L的DEHP處理組，P450scc、3β-HSD、P450c17 mRNA表達(dá)水平與對照組相較都顯著增加(p＜0.05)。0.1μmol/L的DEHP處理組，3β-HSD、P450c17 mRNA表達(dá)水平與對照組相較顯著

10、增加(p＜0.05)，0.001μmol/L的MEHP處理組，3β-HSD mRNA表達(dá)水平與對照組相較都顯著增加(p＜0.05)。4.DBP和MBP處理后INSL3 mRNA表達(dá)水平受到抑制，并且隨染毒劑量的升高逐漸下降，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，而INSL3的蛋白表達(dá)水平在最低劑量組MBP(0.1μmol/L)顯著高于對照組(p＜0.05);而對于DEHP和MEHP組，免疫印跡法(Western Blot)檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本一

11、致，DEHP濃度為0.001μmol/L和0.1μmol/L時INSL3 mRNA和蛋白表達(dá)與對照組相比都顯著增加(p＜0.05); MEHP濃度為0.001μmol/L時INSL3 mRNA和蛋白表達(dá)高于對照組(p＜0.05)。5.流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示在暴露于DEHP后睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的比例顯著增加(p＜0.05)。MEHP處理組細(xì)胞凋亡的比例也有增加的趨勢，且染毒濃度為0.1μmol/L時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。

12、>　　 結(jié)論1.低劑量的DBP、MBP、DEHP和MEHP能刺激MLTC-1細(xì)胞增殖活性，隨濃度的增加，MLTC-1細(xì)胞活性逐漸降低。2.DBP、MBP組DEHP和MEHP低劑量刺激，高劑量抑制MLTC-1細(xì)胞睪酮合成水平。3.實驗中DBP、MBP能降低睪酮合成相關(guān)酶基因的表達(dá)水平，并能抑制INSL3基因蛋白表達(dá)水平;染毒劑量相對較低的DEHP和MEHP對睪酮合成途徑的相關(guān)酶基因和蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用。DBP、MBP組DEHP和ME