西妥昔單抗誘導(dǎo)IGFIR活化介導(dǎo)胃癌細(xì)胞對西妥昔單抗耐藥.pdf

1、目的：
　　近年來，胃癌在全球男性人群中的病死率上升至第三位，女性中第五位，在發(fā)展中國家，胃癌的病死率接近2/3，中國胃癌的病死率達(dá)到42％。20-40％的患者手術(shù)后在2年內(nèi)復(fù)發(fā)。一旦復(fù)發(fā)目前無有效的治療方案，平均中位生存時(shí)間只有6個(gè)月。即使進(jìn)行及時(shí)、規(guī)范的化療，中位生存時(shí)間仍然不足1年。因此，人們將注意力集中在如何將化療與有效的靶向藥物聯(lián)合。西妥昔單抗(Cetuximab C225)是一種抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體

2、，已經(jīng)與化療聯(lián)合廣泛應(yīng)用于K-ras、BRAF基因野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌及非小細(xì)胞肺癌。在胃癌治療方面，Ⅱ期臨床研究證明西妥昔單抗聯(lián)合多種以5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療方案延長患者疾病進(jìn)展時(shí)間，提高反應(yīng)率。但是最近一項(xiàng)大型多中心隨機(jī)Ⅲ期EXPAND臨床研究顯示:西妥昔單抗聯(lián)合順鉑和卡培他濱方案并不能明顯延長進(jìn)展期胃癌患者無進(jìn)展生存時(shí)間。因此，胃癌細(xì)胞可能對西妥昔單抗存在耐藥。
　　目前關(guān)于西妥昔單抗耐藥機(jī)制研究較多，其中替代性

3、通路的活化成為研究焦點(diǎn)。胰島素樣表皮生長因子受體-Ⅰ(ⅠGFIR)是一種跨膜的酪氨酸激酶受體，在很多腫瘤特別是在胃癌中均過表達(dá)。配體與ⅠGFIR結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而活化多重信號通路，包括:Ras/Raf/MAPK（促絲裂原活化蛋白激酶）通路及PI3K/Akt（磷脂酰肌醇3-激酶）信號通路，這也是EGFR下游信號通路。因?yàn)榕cEGFR共用相同的信號通路，因此ⅠGFIR替代性活化可能引起西妥昔單抗耐藥。有研究表明，乳腺癌細(xì)胞中ⅠGFIR

4、過表達(dá)與曲妥珠單抗耐藥有相關(guān)性。另有研究發(fā)現(xiàn)在對西妥昔單抗耐藥的鼻咽癌細(xì)胞中存在ⅠGFIR過度活化。Chad等研究發(fā)現(xiàn)，將ⅠGFIR抑制劑聯(lián)合西妥昔單抗作用于皮膚鱗癌細(xì)胞，可明顯增強(qiáng)西妥昔單抗敏感性。在胃癌細(xì)胞中，是否存在ⅠGFIR的活化，ⅠGFIR活化是否與耐藥有相關(guān)性，目前還未有相關(guān)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)以胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞為研究對象，明確胃癌細(xì)胞對西妥昔單抗敏感性，判斷西妥昔單抗耐藥是否與ⅠGFIR活化相關(guān)。進(jìn)

5、而探討ⅠGFIR活化原因，活化后誘導(dǎo)耐藥的機(jī)制及逆轉(zhuǎn)耐藥方法，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　1、采用MTT法測定細(xì)胞活力。
　　2、采用集落形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖能力。
　　3、采用Western blot檢測ⅠGFIR，Src，EGFR，Akt，ERK蛋白的表達(dá)。
　　4、采用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以(x

6、)±s表示，兩組間差異采用Student's t test分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、胃癌細(xì)胞對西妥昔單抗耐藥
　　通過基因檢測結(jié)果證實(shí):胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞K-ras和BRAF基因呈野生型。
　　將0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞24 h、48 h和72 h，測定增殖抑制率。MTT

7、結(jié)果表明:西妥昔單抗作用于兩種胃癌細(xì)胞，增殖抑制率不足10％。將10μg/ml西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞14天，進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明西妥昔單抗作用于胃癌細(xì)胞后，與對照組相比集落數(shù)量及大小無明顯變化。
　　Western blot結(jié)果顯示:西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞24 h、48h及72 h，從24 h開始EGFR磷酸化明顯減弱，ERK、Akt活性均有一定程度減弱。該結(jié)果證實(shí)

8、，西妥昔單抗在一定程度上封閉了EGFR通路。
　　2、西妥昔單抗可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞ⅠGFIR活化，ⅠGFIR活化參與西妥昔單抗耐藥
　　將10μg/ml西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞0.5h、2h、6h、16h及24 h，Western blot結(jié)果顯示:西妥昔單抗作用于SGC7901細(xì)胞0.5h始，p-ⅠGFIR表達(dá)上調(diào)，6h表達(dá)程度最強(qiáng)，16h活化開始下降。MGC803細(xì)胞在西妥昔單抗作用2h始出現(xiàn)ⅠG

9、FIR活化增強(qiáng)，6h活化程度最強(qiáng)，16h時(shí)恢復(fù)至未加藥水平。
　　將ⅠGFIR抑制劑—OSI-906(10μM)與西妥昔單抗(10μg/ml)聯(lián)合或單獨(dú)作用于胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示:西妥昔單抗單藥作用于兩種胃癌細(xì)胞后，ⅠGFIR活化明顯增強(qiáng)，Akt活化有一定程度減弱，ERK活化明顯減弱;單藥OSI-906即可抑制Akt活化，對ERK活化程度無影響;西妥昔單抗聯(lián)合OSI-906后ⅠGF

10、IR活性被抑制，Akt活性被進(jìn)一步抑制，兩藥聯(lián)合后對ERK抑制作用沒有進(jìn)一步增強(qiáng)。本結(jié)果證明:應(yīng)用ⅠGFIR抑制劑，可抑制由西妥昔單抗誘導(dǎo)的ⅠGFIR活化，同時(shí)Akt受ⅠGFIR調(diào)節(jié)影響更大，而ERK基本不受ⅠGFIR調(diào)節(jié)。MTT實(shí)驗(yàn)及集落形成實(shí)驗(yàn)證明:OSI-906可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對西妥昔單抗的敏感性。
　　利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默ⅠGFIR后，將西妥昔單抗作用于胃癌細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示:沉默ⅠGFIR后，與對照組

11、相比，西妥昔單抗誘導(dǎo)的ⅠGFIR活化明顯降低，p-Akt表達(dá)下調(diào)。西妥昔單抗可很好的封閉ERK，沉默ⅠGFIR后對ERK活性影響不大。同時(shí)MTT結(jié)果證實(shí):沉默ⅠGFIR后，胃癌細(xì)胞對西妥昔單抗敏感性增強(qiáng)。
　　3、Src參與西妥昔單抗誘導(dǎo)的ⅠGFIR活化并與胃癌細(xì)胞西妥昔單抗耐藥相關(guān)
　　10μg/ml西妥昔單抗作用于胃癌SGC7901及MGC803細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示:在SGC7901細(xì)胞中，0.5 h始

12、Src出現(xiàn)活化，隨時(shí)間延長活化程度增加，至16h達(dá)到頂點(diǎn)，后逐漸下降。在MGC803細(xì)胞中，0.5 h始Src出現(xiàn)活化，6h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨著時(shí)間延長活化逐漸減弱。
　　將Src抑制劑PP2(10μM)與西妥昔單抗(10μg/ml)聯(lián)合或單獨(dú)應(yīng)用于胃癌細(xì)胞后，Western blot結(jié)果顯示，西妥昔單抗單藥誘導(dǎo)兩種胃癌細(xì)胞在6h出現(xiàn)ⅠGFIR活化，聯(lián)合應(yīng)用PP2后，ⅠGFIR活化受到抑制。MTT實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:聯(lián)合應(yīng)用

13、PP2后，胃癌細(xì)胞對西妥昔單抗敏感性增強(qiáng)。
　　應(yīng)用ⅠGFIR抑制劑OSI-906(10μM)或利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默ⅠGFIR，與西妥昔單抗(10μg/ml)聯(lián)合或單獨(dú)作用于胃癌SGC7901及MGC803細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示:西妥昔單抗單藥作用2h、6h后可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞Src活化，而聯(lián)合OSI-906或沉默ⅠGFIR后，Src活化被抑制。
　　結(jié)論：
　　1、胃癌SGC7901及MGC803細(xì)胞對西