復(fù)蘇促生長因子結(jié)構(gòu)域及其突變體蛋白誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的一種古老而漫長的感染性疾病,由其導(dǎo)致的死亡率居全球第二位,給各國尤其是發(fā)展中國家?guī)砹顺林氐呢?fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(worldhealthorganization,WHO)統(tǒng)計,2007年全球新增結(jié)核病人937萬,因TB死亡人數(shù)達(dá)132萬(不包括HIV陽性患者)。新增病例中亞洲和非洲分別占55％和31%,其中中國以1

2、30萬新增病例位居第二位,TB防控形勢非常嚴(yán)峻。目前,卡介苗(BacillusCalmetteGuerin,BCG)是唯一一種獲得批準(zhǔn)的廣泛使用的TB預(yù)防疫苗,對于兒童BCG具有良好的保護(hù)效果,但對于成人其保護(hù)效果不容樂觀,對于抑制潛伏期結(jié)核的復(fù)發(fā)更是毫無作用。新發(fā)TB患者主要來源于潛伏MTB感染者,原因在于休眠狀態(tài)MTB的再激活和復(fù)蘇,因此研制新的TB疫苗迫在眉睫。未來的TB疫苗不僅要對剛出生嬰兒以及未感染MTB的人群提供良好的預(yù)防作

3、用,對于已感染MTB但尚未發(fā)病的人群也要具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、加速清除MTB的保護(hù)作用。
　　1.目的
　　檢測藤黃微球菌復(fù)蘇促生長因子結(jié)構(gòu)域(Resuscitation-promotingfactordomain,Rpfd)及其兩個突變體(Rpfd1、Rpfd2)刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體及γ干擾素(Interferonγ,IFN-γ)和白細(xì)胞介素-2(Interleukin2,IL-2)水平,以評價三種因子的免疫原性。

4、>　　2.實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果
　　2.1Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白純化、鑒定
　　將前期制備含谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferase,GST)基因片段重組質(zhì)粒PGEX-4T1-Rpfd、PGEX-4T1-Rpfd1、PGEX-4T1-Rpfd2已轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行活化、轉(zhuǎn)接、誘導(dǎo),獲取表達(dá)產(chǎn)物蛋白,將表達(dá)產(chǎn)物蛋白進(jìn)行純化。應(yīng)用Western-blot方法進(jìn)行蛋白鑒定

5、,鑒定所表達(dá)的蛋白為所需目的蛋白。測定蛋白濃度分別為:Rpfd1.400mg/ml、Rpfd12.438mg/ml、Rpfd23.882mg/ml。
　　2.2Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答
　　將Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加強(qiáng)免疫的方法免疫小鼠,測定其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白均具有很好的免疫原性,能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高

6、效價的抗Rpfd特異性抗體,且三種抗原刺激產(chǎn)生的抗體效價顯著高于BCG免疫組。其中Rpfd2組產(chǎn)生的抗體水平最高,提示其啟動感染宿主體液免疫能力優(yōu)于BCG。使用Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白作為抗原,均能被3種抗體識別,且親合程度趨于一致,說明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白產(chǎn)生的特異性抗體同Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白之間存在交叉免疫反應(yīng),提示該三種蛋白產(chǎn)生的特異性抗體有可能同時封閉MTB的5種Rpf樣蛋白,從而達(dá)到

7、抑制休眠M(jìn)TB復(fù)蘇和生長作用。
　　2.3Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的細(xì)胞免疫應(yīng)答
　　將Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加強(qiáng)免疫的方法免疫小鼠,測定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表達(dá)水平。用MTB毒株H37Rv攻擊免疫小鼠,測定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表達(dá)水平。結(jié)果顯示Rpfd、Rpfd1、Rpfd2具有誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生以IFN-γ、IL-2分泌量明顯增加為主的Th1型免疫應(yīng)答。H3

8、7Rv攻擊小鼠后,Rpfd發(fā)揮其促細(xì)菌生長作用,使小鼠體內(nèi)MTB大量生長,巨噬細(xì)胞吞噬大量MTB后,崩解死亡導(dǎo)致IFN-γ含量明顯下降;而Rpfd1、Rpfd2無促細(xì)菌生長作用,巨噬細(xì)胞吞噬MTB后,未達(dá)到結(jié)核菌負(fù)荷過載,巨噬細(xì)胞殺滅MTB,同時促進(jìn)IFN-γ分泌,故IFN-γ量增加。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白免疫小鼠后,刺激小鼠產(chǎn)生IL-2水平明顯升高,高于BCG免疫組;MTB攻擊免疫小鼠后,三組蛋白免疫組小鼠血清中IL-2

9、檢測量均有下降,Rpfd2蛋白免疫組小鼠血清中IL-2下降尤為明顯,提示IL-2因刺激機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖,強(qiáng)化細(xì)胞保護(hù)性免疫而消耗,Rpfd2組更為明顯。
　　3、結(jié)論
　　Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具有啟動宿主體液免疫功能及增強(qiáng)宿主細(xì)胞免疫功能的雙重作用,可通過激發(fā)宿主細(xì)胞免疫防御MTB的感染,通過刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體封閉體內(nèi)或體外來源的Rpf樣物質(zhì)、從而抑制體內(nèi)處于休眠狀態(tài)的MTB的復(fù)蘇,可成為預(yù)防及治療M