小鼠大腦皮層發(fā)育相關(guān)基因自然反義轉(zhuǎn)錄物的篩選與鑒定.pdf

1、非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，隨著ncRNA重要功能不斷被發(fā)現(xiàn)，越來越引起科學(xué)界對(duì)這些ncRNA的重視。非編碼RNA對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，對(duì)生物生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生等生理過程具有廣泛影響。
　　 長(zhǎng)非編碼RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是指一類長(zhǎng)度大于200nt，但并不具備編碼蛋白質(zhì)功能的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。長(zhǎng)非編碼RNA在生物體生長(zhǎng)發(fā)育

2、的各個(gè)階段發(fā)揮著重要的調(diào)控功能，如在胚胎發(fā)育階段，它可以引起可遺傳的等位基因后期沉默，表觀性狀維持，對(duì)多細(xì)胞動(dòng)物的正常發(fā)育和細(xì)胞分化至關(guān)重要。作為一類新類型的長(zhǎng)非編碼RNA，天然反義轉(zhuǎn)錄物(Naturalantisensetranscripts，NAT)由蛋白編碼基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，其中少數(shù)NAT可以編碼蛋白。它是在自然環(huán)境中生物體內(nèi)存在的反義RNA分子，與對(duì)應(yīng)的正義RNA(senseRNA)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)，發(fā)揮其對(duì)正義基因的調(diào)控作

3、用。
　　 1976年，Barrell等在病毒中發(fā)現(xiàn)NAT的存在，之后相繼在人類、小鼠、大鼠、雞、果蠅、線蟲和水稻、擬南芥、酵母等各種動(dòng)植物中得到證實(shí)。在不同物種中間NAT廣泛存在，如大約15％的人蛋白編碼基因存在NAT。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在真核生物中，NAT通過參與包括基因組印記、RNA干擾、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)、選擇性剪接、X染色體失活和RNA編輯等多種基因表達(dá)調(diào)控過程，影響了生物體的發(fā)育以及疾病的發(fā)生。而我們對(duì)NAT在神經(jīng)

4、系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮的作用還知之甚少，本研究旨在尋找與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的NAT，通過大規(guī)模的篩選與鑒定，尋找小鼠大腦新皮層發(fā)育過程中相關(guān)的基因的NAT，并對(duì)其功能做初步探索。
　　 我們選取了小鼠大腦皮層發(fā)育相關(guān)的63個(gè)基因作為候選基因，這些基因包括了在皮層形成過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，皮層特異層次的標(biāo)記分子等。它們對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育特別是皮層發(fā)育都起到了至關(guān)重要的作用。通過北京大學(xué)NAT預(yù)測(cè)網(wǎng)站http://natsdb.cb

5、i.pku.edu.cn/，對(duì)候選基因進(jìn)行NAT預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示有31個(gè)基因可能存在反義轉(zhuǎn)錄物。我們用成年鼠腦，E12.5天胎腦，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、NIH小鼠成纖維細(xì)胞作為篩選材料，用鏈特異性RT-PCR的方法鑒定，結(jié)果確定了8個(gè)基因存在NAT。為了對(duì)NAT功能進(jìn)行深入探索，我們應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增的方法，對(duì)8個(gè)NAT3’5’末端進(jìn)行擴(kuò)增，得到特異的產(chǎn)物后連接到pGEM-T載體中測(cè)序，結(jié)果得到Id2-NAT,Mef2c-NAT,

6、Foxgl-NAT3’端的序列信息，Lmo4-NAT,Ldb2-NAT,Foxg1-NAT5’端的序列信息。
　　 NAT所發(fā)揮的生物學(xué)功能與其時(shí)空定位密切相關(guān)，為了更好的開展NAT與其基因相互作用關(guān)系的研究，進(jìn)而了解它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，我們首先用原位雜交的方法觀察了Lmo4，Ldb2，F(xiàn)oxg1及其相應(yīng)的反義轉(zhuǎn)錄物在小鼠大腦皮層中的表達(dá)情況，根據(jù)得到的NAT的序列信息設(shè)計(jì)反義轉(zhuǎn)錄物的原位雜交探針，發(fā)現(xiàn)了Foxg1及其NA