骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)阿霉素大鼠足細(xì)胞骨架F-actin的影響及機(jī)制探討研究.pdf

1、第一部分:大鼠BMSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:通過密度梯度離心法分離和提取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得適合實(shí)驗(yàn)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　方法:1.無菌條件下分離SD大鼠股、脛骨,采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離純化BMSCs,通過傳代培養(yǎng),擴(kuò)增和提純BMSCs。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特征。
　　2.成骨誘導(dǎo)試劑和成脂誘導(dǎo)試劑誘導(dǎo)BMSCs向成骨和成脂分化,用VonKossa染色法染色成骨細(xì)胞,用油紅O

2、染色成脂細(xì)胞。
　　3.用流式細(xì)胞測(cè)定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD45、CD90。
　　結(jié)果:鏡下BMSCs呈梭形、多角形成纖維細(xì)胞樣形態(tài),大小均一,漩渦狀生長(zhǎng)。BMSCs在分別加入成骨和成脂誘導(dǎo)劑后能分別誘導(dǎo)出成骨和成脂細(xì)胞。BMSCs表面標(biāo)志顯示第3代BMSCs純度可達(dá)95％以上,其細(xì)胞表型CD29和CD90呈陽性表達(dá),CD34和CD45呈陰性表達(dá)。
　　結(jié)論:用密度梯度離心法分離出來較純的骨

3、髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并且純度能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求
　　第二部分:大鼠足細(xì)胞原代的提取、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:通過過篩法分離腎小球,并進(jìn)行足細(xì)胞原代培養(yǎng),獲得符合實(shí)驗(yàn)要求的足細(xì)胞。
　　方法:1.用80目,150目,200目網(wǎng)篩分離腎小球,并在倒置顯微鏡下觀察腎小球形態(tài)。
　　2.用Ⅳ型膠原酶消化腎小球,種植在用Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),5d后在倒置顯微鏡下觀察腎小球和培養(yǎng)出的細(xì)胞形態(tài)。
　　3.用免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)

4、胞上neprin和WT-1表位。
　　結(jié)果:用網(wǎng)篩法分離出較純腎小球,并用Ⅳ型膠原酶消化后種植在培養(yǎng)瓶中3天左右從腎小球中爬出成鵝卵石樣細(xì)胞,經(jīng)nephrin和WT-1鑒定nephrin能在培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)和包膜上顯色,WT-1在培養(yǎng)的細(xì)胞核周圍顯色。
　　結(jié)論:用Ⅳ型膠原酶消化法能培養(yǎng)出細(xì)胞,且培養(yǎng)出的細(xì)胞為足細(xì)胞,符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　第三部分:大鼠BMSCs對(duì)阿霉素大鼠足細(xì)胞骨架F-actin的影響及機(jī)制探討研究

5、>　　目的:研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)阿霉素引起的足細(xì)胞骨架F-actin的重排的保護(hù)作用及機(jī)制
　　方法:1.BMSCs對(duì)阿霉素引起的足細(xì)胞骨架F-actin重排分組:
　　正常組:足細(xì)胞,
　　阿霉素組:足細(xì)胞+阿霉素
　　干細(xì)胞預(yù)治療組:MSC+足細(xì)胞(共培養(yǎng)24h)+阿霉素
　　干細(xì)胞治療組:MSC+足細(xì)胞+阿霉素
　　地塞米松預(yù)治療組:DEX+足細(xì)胞(共培養(yǎng)24h)+阿霉素
　　地塞米松治

6、療組:DEX+足細(xì)胞+阿霉素
　　各實(shí)驗(yàn)組干預(yù)12h,24h,48h,72h,5d后用TexasRed–Xphalloidin細(xì)胞熒光染各細(xì)胞骨架F-actin。
　　2.BMSCs對(duì)阿霉素引起的足細(xì)胞骨架F-actin重排機(jī)制探討分組:
　　正常組:足細(xì)胞
　　阿霉素組:足細(xì)胞+阿霉素
　　干細(xì)胞對(duì)照組:MSC+足細(xì)胞(共培養(yǎng)24h)
　　干細(xì)胞治療組:MSC+足細(xì)胞(共培養(yǎng)24h)+阿霉素

7、　　地塞米松對(duì)照組:DEX+足細(xì)胞(共培養(yǎng)24h)
　　地塞米松治療組:DEX+足細(xì)胞(共培養(yǎng)24h)+阿霉素
　　各個(gè)實(shí)驗(yàn)組用westernblotting方法測(cè)量足細(xì)胞加入阿霉素后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0min,1min,3min,7min,15min,30min,1h,3h,6h,12h,24h)p-p38變化,然后用westernblotting方法測(cè)量各個(gè)實(shí)驗(yàn)組干預(yù)7min時(shí)p-p38。
　　結(jié)果:1.用TexasRe

8、d–Xphalloidin細(xì)胞熒光染色各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞骨架F-actin結(jié)果:
　　(1)阿霉素組24h時(shí)開始誘導(dǎo)足細(xì)胞細(xì)胞凋亡,但是足細(xì)胞骨架無明顯變化,阿霉素組在48h時(shí)誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架F-actin解聚和紊亂,在72h細(xì)胞接近凋亡,細(xì)胞內(nèi)幾乎無F-actin,而5d細(xì)胞凋亡。
　　(2)干細(xì)胞預(yù)治療組和干細(xì)胞治療組、地塞米松預(yù)治療組和地塞米松治療組能夠在48h、72h、5d相比模型組能夠阻止足細(xì)胞骨架F-actin重組。

9、r>　　(3)干細(xì)胞預(yù)治療組和干細(xì)胞治療組,地塞米松組和地塞米松治療組在阻止足細(xì)胞骨架F-actin重組方面類似。
　　2.Westernbolt結(jié)果示:(1)在足細(xì)胞加入阿霉素后1min,3min,7min,15min,30min的p-p38變化7min時(shí)表達(dá)最多,而在1h,3h,6h,12h,24h時(shí)pp38逐漸減弱。
　　(2)在7min時(shí)干細(xì)胞組和地塞米松組pp38相對(duì)阿霉素組表達(dá)減少,而地塞米松組相對(duì)干細(xì)胞組pp3

10、8表達(dá)減少。
　　結(jié)論:1.干細(xì)胞能保護(hù)阿霉素足細(xì)胞骨架F-actin損害,且預(yù)治療組和治療組效果相似。
　　2.干細(xì)胞和地塞米松可能是通過p38途徑保護(hù)阿霉素足細(xì)胞骨架F-actin損害。
　　第四部分大鼠BMSCs在阿霉素腎病大鼠體內(nèi)示蹤
　　目的:通過小動(dòng)物活體成像儀結(jié)合病理切片示蹤干細(xì)胞在阿霉素腎病大鼠。
　　方法:1.BMSCs在阿霉素腎病大鼠體內(nèi)示蹤分組:
　　空白對(duì)照組:注射生理鹽水

11、r>　　陰性對(duì)照組:注射未染色干細(xì)胞
　　干細(xì)胞對(duì)照組:染色后的干細(xì)胞注射到正常大鼠體內(nèi)
　　干細(xì)胞組:染色后的干細(xì)胞注射到阿霉素腎病大鼠體內(nèi)
　　2.干細(xì)胞組注射鹽酸阿霉素14d后,通過生化儀器測(cè)量24h蛋白尿。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠在10min,1h,2h,5h,8h,24h,48h,72h,1w,2w,3w,4w放入小動(dòng)物成像儀中成像,于24h,48h,72h,1w,2w,3w,4w隨機(jī)抽取三只大鼠處死,把其腎臟放入小動(dòng)

12、物成像儀中成像,并迅速冰凍切片熒光顯微鏡下觀察熒光,之后做HE染色。
　　結(jié)果:1.體表熒光顯示為:正常組和干細(xì)胞對(duì)照組2h后肺部體表熒光消失,而正常對(duì)照組肝臟的體表熒光為10min達(dá)到最亮,之后逐漸減弱,3w后消失,干細(xì)胞組8h達(dá)到最亮,之后逐漸減弱,3w后消失。
　　2.正常組腎臟熒光在24h達(dá)到最亮,之后逐漸減弱,干細(xì)胞組在48h達(dá)到最亮,之后逐漸減弱,且干細(xì)胞組熒光相對(duì)正常組強(qiáng)。
　　3.正常組腎臟冰凍切片在3