胡椒堿對(duì)大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)作用的量效關(guān)系及作用機(jī)理研究.pdf

1、背景:脊髓損傷是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病之一。因其病理過(guò)程復(fù)雜，雖經(jīng)國(guó)內(nèi)外學(xué)者多年的研究，仍缺乏有效的治療方法，仍是醫(yī)學(xué)界難題。依據(jù)對(duì)脊髓損傷后病理生理過(guò)程的新認(rèn)識(shí)和胡椒堿(Piperine)的藥理作用，以及我們先前的研究顯示:胡椒堿對(duì)脊髓損傷大鼠動(dòng)物模型具有保護(hù)作用，但缺乏大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)是否與胡椒堿存在量效關(guān)系的數(shù)據(jù)。因此，設(shè)計(jì)本研究以觀察胡椒堿對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)功能的保護(hù)作用的量效關(guān)系，并對(duì)其可能的作用機(jī)制做進(jìn)一步的探討，為臨床開(kāi)

2、發(fā)新藥提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分，胡椒堿對(duì)大鼠脊髓損傷后肢功能恢復(fù)的量效關(guān)系觀察
　　 目的:
　　 觀察胡椒堿對(duì)大鼠急性脊髓損傷后肢功能的恢復(fù)與胡椒堿的劑量關(guān)系
　　 方法:
　　 (1)動(dòng)物來(lái)源與分組:將72只成年雄性Wistar大鼠（體重250g-320g）應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)分組，分別為假手術(shù)組、胡椒堿溶媒組、胡椒堿1組（25mg/kg）、胡椒堿2組(50mg/kg)、胡椒堿3組(7

3、5mg/kg)、胡椒堿4組(100mg/kg)、胡椒堿5組(125mg/kg)、胡椒堿6組(150mg/kg)，共8組，設(shè)編號(hào)分別為A，B，C，D，E，F(xiàn),G,H，每組9只大鼠。
　　 (2)動(dòng)物模型的制作:所有大鼠在胸10水平后入路椎板切除開(kāi)窗，暴露硬膜囊，假手術(shù)組只打開(kāi)椎板，不撞擊脊髓，其余各組均以改良Allen's法以10g×5cm力撞擊脊髓，制造急性脊髓損傷模型。
　　 (3)給藥方式:造模成功后，假手術(shù)組大鼠給

4、予7ml/kg生理鹽水灌胃給藥，胡椒堿溶媒組大鼠只給予7ml/kg胡椒堿溶媒灌胃給藥，胡椒堿組大鼠按實(shí)驗(yàn)分組要求給予胡椒堿懸濁液（含7ml/kg胡椒堿溶媒）灌胃給藥。每組大鼠都是在術(shù)后1d給予灌胃給藥，每天一次。
　　 (4)大鼠脊髓神經(jīng)功能測(cè)定:術(shù)后采用國(guó)際通用的BBB行為學(xué)評(píng)分法(Basso-Beattie-BresnahanTest)進(jìn)行評(píng)價(jià)后肢功能，術(shù)后1d評(píng)分為0分則納入實(shí)驗(yàn)，表示造模成功，若不是則剔除，剔除的數(shù)量再造

5、模補(bǔ)充，于術(shù)后3d、7d和14d進(jìn)行評(píng)分，其評(píng)分結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 (5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，若符合正態(tài)分布則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，否則用中位數(shù)表示。多個(gè)樣本均數(shù)比較，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布且方差齊則采用one-wayANOVA(F檢驗(yàn))，組間兩兩比較采用SNK-q法或Dunnet-t法檢驗(yàn)，否則采用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗(yàn)的Mann-WhitneyU法。定P＜0.05為有顯著性差異

6、。
　　 結(jié)果:
　　 1、根據(jù)BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后1d，除A組沒(méi)有截癱外，其他各組均出現(xiàn)癱瘓，評(píng)分為0分。術(shù)后3d、7d和14d，A組（假手術(shù)組）術(shù)后無(wú)截癱，評(píng)分均為21分;隨時(shí)間增加B組大鼠后肢功能有所恢復(fù)，BBB評(píng)分分別是（1.444±0.527，2.333±0.500，7.111±1.054）。其余各組中，相同時(shí)間，隨著胡椒堿劑量的增加BBB評(píng)分值增加，C組BBB評(píng)分分別是（2.000±0.707，3.000±0

7、.707，7.778±1.201），D組BBB評(píng)分分別是(3.333±0.866，4.111±0.781，9.889±0.781)，E組BBB評(píng)分分別是（4.778±0.667，6.111±1.269，11.778±1.201），F(xiàn)組BBB評(píng)分分別是（6.000±0.707，8.111±0.781，13.778±0.971），G組BBB評(píng)分分別是(6.444±0.881，8.777±0.666，14.333±0.707)，F(xiàn)組BB評(píng)分分

8、別是(7.000±1.118，9.555±1.013,15.111±0.781)。
　　 2、術(shù)后3d、7d、14d，A組與各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，P＜0.05）。B組（溶媒組）與各劑量組的比組較中發(fā)現(xiàn)，小劑量時(shí)無(wú)明顯作用，大劑量時(shí)其作用變化不明顯。術(shù)后3d、7d、14d，C組(25mg/kg)與B組（溶媒組）比較(p=0.706,P=0.435,P=0.980，P＞0.05)差異不明顯。當(dāng)劑量大于50mg/kg

9、時(shí)，隨著胡椒堿劑量增加差異逐漸明顯，B、C、D、E、F組相互比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而劑量大于125mg/kg時(shí)隨著胡椒堿劑量的增加，其作用效果變化不明顯，F(xiàn)組(100mg/kg)與G組(125mg/kg)(P=0.988,P=0.669，P=0.952,P＞0.05)，G組(125mg/kg)與H組(150mg/kg)(P=0.989,P=0.684,P=0.490,P＞0.05),F組(100mg/kg)與H組(150m

10、g/kg)(P=0.463,P=0.069,P=0.096,P＞0.05)比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相同時(shí)間，B組與C組、D組、E組比較及其相互比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明胡椒堿的用量存在最適劑量范圍。
　　 3、根據(jù)本實(shí)驗(yàn)觀察，隨著給藥劑量的增加，大鼠后肢功能恢復(fù)力提高，但是藥物的毒性亦增加，在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為大鼠生存時(shí)間縮短，當(dāng)胡椒堿劑量大于125mg/kg時(shí)，劑量越大，生存時(shí)間越短。綜合效應(yīng)與毒性，胡椒堿促進(jìn)脊髓損傷恢

11、復(fù)的最適濃度為50～100mg/kg。
　　 結(jié)論:
　　 (1)經(jīng)胃灌注一定劑量的胡椒堿對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用，且這種效應(yīng)與胡椒堿的用量在一定程度上呈劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 (2)超大劑量的胡椒堿具有毒性作用，胡椒堿促進(jìn)脊髓損傷的最適濃度為50～100mg/kg。
　　 第二部分，胡椒堿對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能保護(hù)的作用機(jī)制研究
　　 目的:
　　 進(jìn)一步探討胡椒堿對(duì)大

12、鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)功能保護(hù)的作用機(jī)制
　　 方法:
　　 (1)取成年雄性Wistar大鼠(體重250g-320g)48只，分組方法同實(shí)驗(yàn)第一部分，但是每組6只大鼠。動(dòng)物模型的制作、給藥方式和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)同第一部分。各組于術(shù)后3d、7d時(shí)各分別隨機(jī)取3只處死、取材，留取脊髓損傷部位長(zhǎng)約5mm的脊髓組織作為病理標(biāo)本，用4％多聚甲醛液固定48小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，4℃保存，備用。
　　 (2)術(shù)后3d、7d、14d的脊髓

13、標(biāo)本均進(jìn)行常規(guī)HE染色觀察其病理變化，用免疫組化檢測(cè)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的含量變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、脊髓病理HE染色結(jié)果
　　 術(shù)后3d，A組（假手術(shù)組）脊髓組織完整，細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯壞死及空洞，脊髓灰白質(zhì)界限清楚、神經(jīng)元及髓鞘結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)好，數(shù)量多，胞膜完整。而其他組均有不同程度的變化，從局部片狀出血壞死、周?chē)仔约?xì)胞的浸潤(rùn)、神經(jīng)元胞體的萎縮、膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生、白質(zhì)呈

14、網(wǎng)狀脫髓鞘。術(shù)后7d和14d，A組（假手術(shù)組）病理無(wú)明顯改變，其他各組均有不同程度的好轉(zhuǎn)，隨著胡椒堿給藥劑量的增加，脊髓損傷區(qū)面積逐漸減小而正常組織增多，組織連續(xù)性增加，并可見(jiàn)到膠質(zhì)細(xì)胞增生及疤痕形成，損傷區(qū)囊腔樣變。
　　 2、免疫組化結(jié)果
　　 2.1、TNF-α的表達(dá)
　　 2.1.1、TNF-α在脊髓損傷中心表達(dá)最明顯，A組表達(dá)最少，B組表達(dá)最多，術(shù)后3d、7d、14d，A組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為（7.83

15、3±1.169，5.833±0.752，4.833±1.471），染色強(qiáng)度分別是(0，0，0)，IHS分別是(0，0，0)。B組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為(86.333±1.211，79.666±1.032，67.666±1.632)，染色強(qiáng)度分別是(3，3，3)，IHS分別是(12，12，9)。小劑量時(shí)作用不明顯，C組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為（85.166±1.169，78.166±0.752，66.333±1.366），染色強(qiáng)度分別是(3，3

16、，3)，IHS分別是(12，12，9)。相同時(shí)間，其余劑量組隨劑量增加，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，染色減低。D組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為(82.166±1.169，74.00±0.894，62±1.549)，染色強(qiáng)度分別是(3，2.5，2)，IHS分別是(12，7.5，6);E組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為（79.00±0.894，70.33±1.505，58.166±1.169），染色強(qiáng)度分別是(2.5，2.5，2)，IHS分別是(10，7.5，6);F組

17、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為(75.00±0.894，65.666±1.632，54.5±1.516)，染色強(qiáng)度分別是(2，2，1)，IHS分別是(6，6，3);G組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為(73.833±0.752，64.666±1.940，53.166+1.169)，染色強(qiáng)度分別是(2，2，1)，IHS分別是(6，6，3);H組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為(72.666±0.333，62.666±1.751，52.00+1.414)，染色強(qiáng)度分別是(2

18、，1，1)，IHS分別是(6，3，3)。
　　 2.1.2、術(shù)后3d、7d、14d，A組分別與各組比較均有顯著性差異(P＜0.05）。術(shù)后3d、7d、14d，B組與各劑量組相互比較，發(fā)現(xiàn)早期小劑量給藥時(shí)效果不明顯，B組與C組(P=0.813,P=0.224,P=0.889,P＞0.05)比較無(wú)明顯差異;B組與D、E、F、G、H組均有明顯差異(P＜0.05)。各劑量組間(C、D、E、F、G、H組)比較，C、D、E、F組比較均有有統(tǒng)

19、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），F(xiàn)、G、H組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后3d，F(xiàn)組與G組(P=0.388，P＞0.05)，G組與H組(P=0.327，P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.054，P＞0.05)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后7d，F(xiàn)組與G組(P=0.922,P＞0.05)，G組與H組(P=0.936,P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.162,P＞0.05)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后14d，F(xiàn)組與G組(P=0.807，P＞0.05)，G組與H

20、組(P=0.879,P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.192,P＞0.05)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在一定范圍內(nèi)隨著給藥劑量的增加，差異較明顯，當(dāng)達(dá)到一定劑量后差異無(wú)明顯變化，說(shuō)明存在最適作用劑量。
　　 2.2、IL-6的表達(dá)
　　 2.2.1、IL-6表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞也主要位于損傷中心區(qū)，在周邊區(qū)逐漸減少。術(shù)后3d、7d、14d，A組未見(jiàn)或很少見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，隨時(shí)間無(wú)明顯變化，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別是(4.83±1.16，4.50

21、±0.54，3.33±0.81)，細(xì)胞顯色強(qiáng)度分別是(0，0，0)，IHS分別為(0，0，0);B組表達(dá)最多，且染色強(qiáng)度最大，術(shù)后3d，小劑量組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多，但是差異不明顯，隨胡椒堿劑量的增加陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞顯色強(qiáng)度有所減低，B、C、D、E、F、G、H組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為(85.166±3.656，83.833±0.752，77.166±1.471，73.333±1.032，68.00±1.788，66.666±1.632，

22、64.833+1.169)，細(xì)胞顯色強(qiáng)度分別是(3，3，3，2.5，2.5，2，2)，IHS分別為(12，12，12，10，6，6，6)。術(shù)后7d各劑量組陽(yáng)性細(xì)胞減少，隨著劑量增加陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞顯色強(qiáng)度逐漸減低，差異比較明顯，B、C、D、E、F、G、H組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為(81.833±1.471，80.333±1.505，73.166±2.228，67.166±1.940，60.666±1.211，59.000±1.141

23、，57.833±0.983)，細(xì)胞顯色強(qiáng)度分別是(3，3，2.5，2.5，2，2，1)，IHS分別為(12，12，12，7.57.5，6，6)。術(shù)后14d，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，基本穩(wěn)定，仍高于A組，B、C、D、E、F、G、H組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)分別為(74.50±0.836，73.833±0.752，69.833±1.602，63.666±1.211，57.00±3.033，55.333±1.366，53.5±1.378)，細(xì)胞顯色強(qiáng)度分別

24、是(3，3，2，2，1，1，1)，IHS分別為(9，9，6，6，3，3，3)。
　　 2.2.2、術(shù)后3d、7d、14d，A組分別與各組比較均有顯著性差異(P＜0.05）。術(shù)后3d、7d、14d，B組與各劑量組相互比較，早期小劑量給藥時(shí)效果不明顯，B組與C組(P=0.998,P=0.787,P=0.921，P＞0.05)比較無(wú)明顯差異;B組與C、D、E、F、G、H組均有明顯差異(P＜0.05)。各劑量組間(C、D、E、F、G、H

25、組)比較，C、D、E、F組比較均有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)、G、H組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后3d，F(xiàn)組與G組(P=0.952，P＞0.05)，G組與H組(P=0.501,P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.083，P＞0.05)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后7d，F(xiàn)組與G組(P=0.522,P＞0.05)，G組與H組(P=0.829,P＞0.05)，F(xiàn)組與H組(P=0.052,P＞0.05)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后14d，F(xiàn)組與G組(P=0