載脂蛋白E對原代大鼠皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的影響.pdf

1、目的：采用激光共聚焦鈣離子熒光成像技術(shù)觀察不同亞型載脂蛋白E(apoE4，apoE3)對原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元胞內(nèi)靜息鈣水平和NMDA誘發(fā)鈣反應(yīng)的影響。 方法：熒光染料選Fluo-3/AM，對皮層神經(jīng)元有效負載后在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并記錄其胞內(nèi)靜息鈣水平或其變化。根據(jù)藥物作用時間將實驗分為急性和慢性兩部分。在急性實驗部分，培養(yǎng)10d的皮層神經(jīng)元洗去培養(yǎng)基，負載染料，先記錄1min的胞內(nèi)靜息鈣水平，然后，分別給予不同濃度

2、的重組人apoE4、apoE3和MK801，動態(tài)觀察胞內(nèi)鈣水平的變化20min。最后給予100μmol/L NMDA，繼續(xù)觀察1min以了解皮層神經(jīng)元對NMDA的鈣反應(yīng)。在慢性實驗部分，皮層神經(jīng)元培養(yǎng)8d后進行藥物干預(yù)，作用48h，洗去培養(yǎng)基，負載染料，觀察胞內(nèi)靜息鈣水平1min；然后給予100μmol/L NMDA，觀察皮層神經(jīng)元NMDA鈣反應(yīng)1min。 結(jié)果：(1)急性給予apoE4劑量依賴性和時間依賴性升高了細胞內(nèi)的靜息鈣

3、水平。100nmol/L和300nmol/L apoE4給藥后20min，神經(jīng)元胞漿相對鈣熒光強度升高到137.74±6.89％和154.05±7.60％，與對照組(100.42±8.06％)相比具有顯著性差異(P＜0.01)；同一濃度(300nmol/L)的apoE4在給藥后5min、10min和20min不同時間點，其相對熒光密度分別升高到118.25±8.08％、138.74±7.57％和154.05±7.60％，存在顯著差異(P

4、＜0.01)。(2)急性給予apoE4引起的胞內(nèi)鈣水平增高可以被NMDA受體非競爭性拮抗劑MK801部分阻斷。急性給予100nmol/LapoE4引起的[Ca2+]ⅰ升高(137.74±6.89％)被MK801降至116.76±8.35％(P＜0.05)。(3)急性給予apoE4同樣顯著性增強了NMDA誘發(fā)的鈣反應(yīng)。對照組NMDA誘發(fā)的鈣升高為317.86±8.56％，急性給予100nmol/L和300nmol/L apoE4使NMDA

5、(100μmol/L)誘發(fā)的鈣反應(yīng)增加至335.75±9.65％(P＜0.05)和360.78±8.35％(P＜0.01)。(4)慢性apoE4預(yù)處理也顯著升高了胞內(nèi)鈣水平，并且也被MK801有效阻斷。100nmol/L和300nmol/L apoE4作用48h后[Ca2+]ⅰ顯著升高到172.51±5.40％和201.24±1.29％(P＜0.01)；MK801則使100nmol/L apoE4引起的[Ca2+]ⅰ升高降至131.04

6、±2.09％(P＜0.01)。但慢性apoE4預(yù)處理卻使NMDA引起的鈣反應(yīng)明顯降低。100nmol/L和300nmol/L apoE4作用48h，使NMDA引起的鈣反應(yīng)峰值從對照組的317.86±8.56％分別降至200.75±9.65％和154.78±8.35％(P＜0.01)。(5)即使在高濃度下(300nmol/L)，急性、慢性apoE3處理均未引起細胞內(nèi)靜息鈣水平及NMDA鈣反應(yīng)的顯著改變。 結(jié)論：(1)ApoE4急性

7、作用可以顯著升高神經(jīng)元胞內(nèi)靜息[Ca2+]ⅰ，且呈濃度依賴與時間依賴效應(yīng)，而apoE3則無影響；MK-801可減弱apoE4急性作用引起的胞內(nèi)靜息[Ca2+]ⅰ升高，而MK-801單獨作用無影響；(2)ApoE4急性作用可以明顯增加NMDA誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子濃度升高，且呈濃度依賴效應(yīng)，而apoE3則無影響；(3)ApoE4慢性作用可以濃度依賴性地升高神經(jīng)元胞內(nèi)靜息[Ca2+]ⅰ，而apoE3則無影響，MK-801預(yù)處理可減弱apoE4引起

8、的胞內(nèi)靜息[Ca2+]ⅰ升高，但不能完全阻斷該效應(yīng)；(4)ApoE4慢性作用可降低NMDA誘發(fā)的胞內(nèi)鈣反應(yīng)，呈濃度依賴效應(yīng)，而apoE3則無影響，MK-801預(yù)處理可以部分逆轉(zhuǎn)apoE4慢性作用引起的NMDA胞內(nèi)鈣反應(yīng)降低。 鈣成像實驗結(jié)果提示，即使在生理濃度下，apoE4也可通過激活NMDA受體而擾亂神經(jīng)元胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。由此導(dǎo)致的細胞內(nèi)鈣超載可能是AD發(fā)病早期的關(guān)鍵事件，據(jù)此設(shè)計特異性NMDA受體阻斷劑將有可能成為保護神經(jīng)元免受