大蒜素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡及凋亡途徑的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:大蒜素(Allicin)為百合科植物大蒜鱗莖中提取的特有的含硫化合物，傳統(tǒng)上大蒜素被用于抗細(xì)菌、病毒和真菌的感染。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，大蒜素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有明顯抑制作用。而且，這種抑制作用對(duì)機(jī)體幾乎沒(méi)有毒副作用。前期研究表明大蒜素可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，但對(duì)其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制尚不清楚。為探索大蒜素的抗癌機(jī)制，我們采用大蒜素在體外作用于人肝癌細(xì)胞HepG-2，通過(guò)不同層面的凋亡檢測(cè)技術(shù)，從細(xì)胞分子水平觀察研究大蒜素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)

2、胞的凋亡作用、對(duì)線粒體膜電位及細(xì)胞色素c的影響，探討大蒜素的抗癌機(jī)制，從而為大蒜素治療肝癌提供更充足的理論依據(jù)。方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2，經(jīng)大蒜素分別處理(大蒜素終濃度分別為20,40，60μg/ml)，檢查時(shí)間點(diǎn)分別為(4h,8h,6h)后，用四甲基偶氮哇藍(lán)(MTT)比色還原法計(jì)算大蒜素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2，經(jīng)不同濃度大蒜素(終濃度為20,40，60μg/ml)作用8小時(shí)

3、后，采用相差倒置顯微鏡、常規(guī)HE染色、Hoeches33258熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，DNA凝膠電泳分析誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG，經(jīng)大蒜素濃度為40μg/ml作用4小時(shí)后用熒光染料JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化，同時(shí)用免疫組化法檢測(cè)大蒜素對(duì)細(xì)胞中細(xì)胞色素C的影響。結(jié)果:大蒜素能明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖，除大蒜素組(大蒜素濃度20 mg/L組)作用4h和8h抑制率與陰性對(duì)照組抑制率比較無(wú)顯著差異(P

4、>0.05)外，其它不同濃度、時(shí)間點(diǎn)間的大蒜素組抑制率與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且呈濃度、時(shí)間依賴性，抑制率隨濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高。不同濃度大蒜素作用肝癌細(xì)胞8小時(shí)后，倒置相差顯微鏡觀察到不同程度的細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞之間連接減少，細(xì)胞皺縮，折光度上升，邊緣不規(guī)則等凋亡形態(tài)學(xué)改變，而對(duì)照組細(xì)胞輪廓清晰，核呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)飽滿，核膜輪廓明顯，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片。HE染色觀察到不同程度的細(xì)胞體積皺縮、核濃

5、縮、核邊集以及凋亡小體形成等凋亡形態(tài)學(xué)改變，陰性對(duì)照組形態(tài)正常，核大小均一，貼壁良好。Hoechest熒光染色觀察可見(jiàn)核濃縮，致密的強(qiáng)熒光團(tuán)塊、凋亡小體等形態(tài)學(xué)變化，呈一定量效關(guān)系，陰性對(duì)照組則發(fā)微弱藍(lán)熒光；DNA凝膠電泳可見(jiàn)大蒜素濃度組(40、60mg/L)有典型的梯狀條帶(DNA Ladder)出現(xiàn)。大蒜素40mg/L處理HepG2細(xì)胞4小時(shí)后，應(yīng)用熒光染色來(lái)檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞和大蒜素組細(xì)胞中的線粒體跨膜電位的變化，觀察到大蒜素處理后的

6、凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)亮綠色熒光，而對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)均勻黃綠色熒光，說(shuō)明有線粒體膜電位的改變。同時(shí)應(yīng)用免疫化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的胞漿中幾乎無(wú)棕黃色顆粒表達(dá)很少，而經(jīng)40mg/L濃度大蒜素處理4小時(shí)后的細(xì)胞，可見(jiàn)胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒的陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)結(jié)論:①大蒜素對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，除大蒜素濃度20mg/L組作用4h和8h抑制率與陰性對(duì)照組抑制率比較無(wú)顯著差異(P>0.05)