淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ延長健康壽限及其作用機制的研究.pdf

1、衰老相關(guān)疾病與衰老進(jìn)程本身具有同源性。干預(yù)衰老能夠降低衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，延長健康壽命，是實現(xiàn)健康老齡化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前仍缺乏有效的延緩衰老手段。中醫(yī)藥學(xué)在養(yǎng)生健體、延緩衰老方面歷史悠長。在前期補腎延緩衰老系列研究中，我們發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮(EF)為補腎抗衰老復(fù)方改善內(nèi)分泌免疫衰老的主要有效成分。壽命為評價衰老干預(yù)手段的核心指標(biāo)，但是EF能否延長壽命還屬未知。淫羊藿苷(Icariin，ICA)是EF的主要成分，但I(xiàn)CA是否為EF延長

2、壽命的有效成分需進(jìn)一步研究。
　　 延長壽命更重要的是延長有功能意義的健康壽命，因此檢測衰老干預(yù)手段對老年機體健康狀態(tài)的改善作用尤為重要。目前對老年機體健康狀態(tài)的檢測主要包括壓力應(yīng)激能力、衰老退行性改變以及衰老相關(guān)疾病等3個方面。ICA能否改善機體的健康狀態(tài)，延長健康壽命還屬未知。
　　 現(xiàn)代藥理研究證實，ICA經(jīng)吸收后在體內(nèi)被迅速代謝為淫羊藿次苷Ⅰ(IcarisideⅠ，ICSⅠ)、次苷Ⅱ(IcarisideⅡ，ICS

3、Ⅱ)及淫羊藿素(Icaritiin，ICT)。ICA是以其原型還是代謝衍生物發(fā)揮延長健康壽命的作用值得研究。目前研究證實，Insulin/IGF-1通路(ⅡS)、Targetofrapamycin通路(TOR)、沉默信息調(diào)節(jié)子Sirtuins家族以及AMPkinase(AMPK)等為壽命調(diào)控的核心分子機制。其中ⅡS通路已被證實能夠調(diào)節(jié)包括低等和高等生物在內(nèi)的一系列物種的壽命，其作用在進(jìn)化上高度保守。尋找這些壽命調(diào)控通路的靶向藥物是抗衰老

4、研究的一個主要目標(biāo)。在揭示ICA為EF發(fā)揮作用的單一成分后，ICA及其體內(nèi)活性代謝衍生物是否通過上述衰老調(diào)控通路發(fā)揮作用值得探索。
　　 模式生物秀麗隱桿線蟲(以下簡稱線蟲)是衰老研究的經(jīng)典模式生物，具有實驗操作簡單、遺傳背景清晰等優(yōu)點，易于進(jìn)行壽命實驗和作用機制的探索，但低等生物畢竟與人類相差太遠(yuǎn)，藥物的確切效果還需進(jìn)一步通過哺乳動物和人類細(xì)胞的驗證。因此，在本研究中我們采用了線蟲、C57BL/6小鼠及人類成纖維二倍體細(xì)胞模型

5、MRC-5等3種實驗?zāi)Ｐ停Y(jié)合各實驗?zāi)Ｐ偷膬?yōu)勢來探索藥物延緩衰老的作用及其機制。
　　 目的：
　　 1.研究EF及其主要成分ICA干預(yù)壽命的效果。
　　 2.評價ICA對老年健康狀態(tài)的改善作用；
　　 3.探討ICA延長健康壽命的體內(nèi)活性成分及其分子機制。
　　 方法：
　　 1.EF及ICA干預(yù)壽命的研究
　　 1.1 野生型線蟲N2分組為對照組、EF高(100mg/mL)、中

6、(50mg/mL)、低劑量組(25mg/mL)；對照組、ICA高(75μM)、中(45μM)、低(15μM)劑量組進(jìn)行壽命實驗；
　　 1.2 C57BL/6雄性小鼠分組為正常對照組、EF組(0.06％，w/w)及ICA組(0.02%，w/w)，進(jìn)行壽命實驗，記錄各組小鼠體重、飼料日耗量、飲水量、大便小便量，小鼠自然死亡后行大體解剖觀察腫瘤發(fā)生及皮膚潰瘍情況。
　　 1.3 人二倍體成纖維細(xì)胞MRC-5分組為對照組、EF

7、組(3mg/mL)及ICA組(10-6mol/L)，檢測細(xì)胞傳代次數(shù)(PD)；
　　 2.ICA影響老年健康狀態(tài)的研究
　　 2.1 壓力應(yīng)激能力：野生型線蟲N2分組為對照組、ICA組(45μM)，進(jìn)行熱壓力應(yīng)激及氧化壓力應(yīng)激實驗，觀察ICA對壓力應(yīng)激能力的影響；
　　 2.2 衰老退行性病變：MRC-5細(xì)胞分組為對照組、ICA組(10-6mol/L)，進(jìn)行細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色實驗；野生型線蟲N2分組為

8、對照組、ICA組(45μM)，進(jìn)行游泳能力測試；線蟲突變體PD4251分組為對照組、ICA組(45μM)，進(jìn)行肌肉細(xì)胞計數(shù)；C57BL/6小鼠的分組對照組、ICA組，同時取3月齡小鼠作為青年對照，進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實驗、骨密度檢測及重要臟器病理觀察，觀察ICA對衰老退行性病變的影響；
　　 2.3 衰老相關(guān)疾?。壕€蟲疾病模型突變體AM140、CLA176分組為對照組、ICA組(45μM)，觀察ICA對谷氨酰胺重復(fù)序列(PolyQ)及人類β

9、-淀粉樣肽(Aβ1-42)蛋白毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變的作用，檢測ICA對衰老相關(guān)疾病的作用。
　　 3.ICA的體內(nèi)代謝衍生物ICSⅡ延長健康壽命作用機制的研究
　　 3.1 野生型線蟲N2分組為對照組及藥物干預(yù)組，觀察ICA及其衍生物ICSⅠ、ICSⅡ、ICT對壽命的影響并結(jié)合高效液相(HPLC)檢測ICA和各衍生物在野生型線蟲體內(nèi)的濃度；
　　 3.2 野生型線蟲N2分組為對照組、ICSⅡ組(20μM)，進(jìn)

10、行壓力應(yīng)激實驗、游泳能力測試、肌肉細(xì)胞計數(shù)，觀察藥物對衰老相關(guān)退化的改善作用；線蟲疾病模型突變株AM140、CLA176分組為對照組、ICSⅡ組(20μM)，觀察藥物對PolyQ及Aβ1-42蛋白毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變的影響。
　　 3.3 不同遺傳背景的線蟲突變體分組為對照組、ICSⅡ組(20μM)，進(jìn)行壽命實驗(GeneticEpistasisExperiment)，探討藥物作用機制，并進(jìn)一步用實時定量RT-PCR、Wes

11、ternBlot及相關(guān)基因GFP報告體檢測藥物對相關(guān)通路下游靶基因的表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.EF及其主要成分ICA能顯著延長多個物種實驗?zāi)Ｐ偷膲勖?br>　　 EF及ICA呈劑量依賴性右移野生型線蟲的生存曲線，提高線蟲平均壽命及最大壽命；顯著右移小鼠的生存曲線，顯著提高小鼠平均壽命，對小鼠的最大壽命無明顯影響。藥物干預(yù)對小鼠自發(fā)腫瘤及皮膚潰瘍發(fā)生率無明顯影響。EF及ICA能顯著提高人類二倍體細(xì)胞MRC-5

12、的傳代次數(shù)；
　　 2.ICA能顯著改善老年健康狀態(tài)
　　 ICA能顯著降低MRC-5細(xì)胞衰老特異性β-半乳糖苷酶的表達(dá)，提高線蟲的熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激能力及運動能力，改善線蟲衰老相關(guān)肌肉萎縮，延長小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期時間；ICA能降低蛋白毒性介導(dǎo)的線蟲癱瘓表型，提高老年小鼠股骨骨密度。經(jīng)ICA干預(yù)過的小鼠肝組織中衰老相關(guān)病理改變明顯減輕。藥物長期干預(yù)對小鼠主要臟器無明顯毒性影響。
　　 3.ICA及其活性代謝物衍生物IC

13、SⅡ通過ⅡS通路延長健康壽命。
　　 在野生型線蟲上對ICA及ICA代謝衍生物進(jìn)行壽命實驗顯示20μMICSⅡ能獲得與45μMICA同等的延長壽命的效果，HPLC結(jié)果顯示在秀麗線蟲中測得的化合物主要為ICA及其代謝衍生物ICSⅡ，提示ICSⅡ為ICA發(fā)揮抗衰老作用的體內(nèi)活性衍生物。ICSⅡ能顯著提高野生型線蟲的熱應(yīng)激及氧化應(yīng)激能力，提高老年線蟲的運動能力，降低衰老相關(guān)肌肉萎縮，減低PolyQ及Aβ1-42的蛋白毒性。ICA及IC

14、SⅡ不能影響ⅡS通路上游基因daf-2突變體、下游核心轉(zhuǎn)錄因子daf-16突變體及協(xié)助轉(zhuǎn)錄因子hsf-1突變體的壽命，提示藥物作用機理與ⅡS通路相關(guān)。進(jìn)一步的實時定量RT-PCR、WesternBlot及SOD-3綠色熒光報告實驗結(jié)果結(jié)果顯示，ICSⅡ能增強ⅡS通路的核心轉(zhuǎn)錄因子DAF-16的轉(zhuǎn)錄活性，提高其下游有益靶基因的表達(dá)，從而延長健康壽命。
　　 結(jié)論：
　　 綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)EF、ICA及ICSⅡ能改善多