定點(diǎn)整合hFlX的人胚胎干細(xì)胞體外定向分化成造血系細(xì)胞的研究.pdf

1、輸注血細(xì)胞和移植造血干細(xì)胞是細(xì)胞治療的常用手段，可以用來(lái)治療遺傳性疾病、惡性血液病和重癥免疫缺陷等多種疾病。造血系細(xì)胞也是采用ex vivo基因治療策略的重要靶細(xì)胞。本研究組前期已經(jīng)利用人核糖體基因區(qū)打靶載體(pHrneo)將人凝血因子IX(hFIX)靶入到人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)的rDNA區(qū)，因此將hESCs定向分化成造血系細(xì)胞，將為今后利用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedplu

2、ripotent stem cells，iPSCs)實(shí)現(xiàn)血友病B的個(gè)體化基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：本研究對(duì)人胚胎干細(xì)胞系H9以及本室定點(diǎn)整合治療基因hFIX的hESCs克隆進(jìn)行了體外定向誘導(dǎo)分化。實(shí)驗(yàn)的主要技術(shù)是將hESCs培養(yǎng)于低黏附培養(yǎng)皿中形成擬胚體(human embryoid bodies，hEBs)，再進(jìn)一步定向分化成造血系細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中我們嘗試了三種分化誘導(dǎo)方法，spinhEBs法、懸浮-貼壁法和半固體-液體

3、法。在誘導(dǎo)的過(guò)程中，我們收集了分化第0-26天的hEBs進(jìn)行半定量RT-PCR，以鑒定誘導(dǎo)過(guò)程中造血標(biāo)志基因的變化；此外，收集培養(yǎng)11天的hEBs，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其中CD34、CD38等造血表面抗原的表達(dá)情況，以確定造血分化的效率；分化26天后，用瑞氏(Wright)-吉姆薩(Giemsa)混合染色從形態(tài)學(xué)上鑒定分化后所包含的各類成熟的造血系細(xì)胞。
　　 結(jié)果：spin hEBs法未能形成分化所需的hEBs，而懸浮-貼壁法和

4、半固體-液體法均成功的獲得了大量的hEBs用于后續(xù)分化。半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了造血系細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞具有造血系細(xì)胞的一般特性，表達(dá)CD34、TAL-1/SCL、GATA-2、RUNX-1、MIXL-1、FLK-1/KDR等造血相關(guān)基因，而且定點(diǎn)整合克隆仍然表達(dá)治療基因人凝血因子IX。流式細(xì)胞檢測(cè)到CD34、CD38陽(yáng)性率分別為48.75％和30.98％；此外，瑞氏-吉姆薩混合染色法觀測(cè)可見紅細(xì)胞