P15INK4b慢病毒感染聯(lián)合Bcr-abl siRNA及STI571對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞性白血?。╟hronic myeloid leukemia. CML）是一種起源于多能干細(xì)胞異常克隆的惡性增殖性疾病，約占白血病總發(fā)病率的15％，多見于老年人。絕大多數(shù)CML患者白血病細(xì)胞中具有費(fèi)城染色體（Ph染色體），它是有9號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)4帶和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶相互易位融合而成，使位于9號(hào)染色體上的c-abl1原癌基因在第二外顯子的5’端斷裂，與22號(hào)染色體的M-Bcr基因第2或第3外顯子的3’端結(jié)合，形成Bcr-

2、abl融合基因，該基因編碼P210蛋白，具有持續(xù)而強(qiáng)烈的酪氨酸激酶活性，可使粒細(xì)胞發(fā)生惡性增殖。
　　基于 Bcr-abl融合基因在慢性粒細(xì)胞性白血病中的重要病理意義，諾華制藥公司于2001成功開發(fā)Bcr-abl特異性抑制劑--STI571用于CML的治療，成為第一個(gè)靶向治療藥物。STI571的應(yīng)用使原來CML的5年生存率由20%提升至90%，被稱為是CML治療史上的里程碑。然而，隨后8年隨訪研究發(fā)現(xiàn)約16%的患者因藥效降低停止服

3、用STI571，有6%的患者由于不良反應(yīng)而停止用藥。隨著STI571在CML治療中的大量應(yīng)用，其耐藥性的問題已愈發(fā)明顯，尤其是Bcr-abl基因突變位點(diǎn)的增多，出現(xiàn)了越來越多STI571治愈無(wú)效的CML患者。因此，尋找抑制效能更強(qiáng)或Bcr-abl以外的新靶點(diǎn)是當(dāng)前CML治療研究的一項(xiàng)前沿課題。最近的研究表明CML的治療需在抑制Bcr-abl的基礎(chǔ)上，同時(shí)聯(lián)合其它新發(fā)現(xiàn)或確認(rèn)的靶點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合治療，可顯著提高CML的治愈率。
　　P15

4、INK4b是細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑INK4家族的一員，又被稱作CDKN2b和MTS2,它位于人類9號(hào)染色體，通常與P16INK4a和P14ARF一起發(fā)生改變。P16INK4a和P15INK4b都可通過抑制CDK4/6，使細(xì)胞停滯于G1期。在血液病中，P16INK4a和P15INK4b表達(dá)降低通常是由于外界原因使基因發(fā)生甲基化所導(dǎo)致。而且，P15INK4b是唯一在MDS和AML中發(fā)生甲基化的INK4家族成員，提示它在粒細(xì)胞疾病中的具有特異

5、性。臨床研究顯示50-60%的骨髓異常增殖綜合癥患者和70-80%急性粒細(xì)胞性白血病患者都會(huì)發(fā)生 P15INK4b的甲基化改變，提示我們P15INK4b可能參與了白血病的病理過程。
　　P15INK4b的生物學(xué)活性研究表明它具有以下3方面的特性：1.P15INK4b在體內(nèi)具有腫瘤抑制因子的作用，逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的髓性單核粒細(xì)胞性白血病存在明顯的P15INK4b基因5’CpG島甲基化改變，而當(dāng)P15INK4b缺失被重新構(gòu)建時(shí)，粒細(xì)胞增

6、殖情況得到顯著抑制。2. P15INK4b顯示可以促進(jìn)造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞的分化，抑制其向粒細(xì)胞的分化。3. P15INK4b在促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟中的作用，增強(qiáng)免疫監(jiān)督作用。上述三種生物學(xué)活性均表明P15INK4b可能成為治療CML的潛在靶點(diǎn)。
　　基于上述理論基礎(chǔ)，本研究旨在觀察P15INK4b與Bcr-abl抑制聯(lián)合應(yīng)用是否可提高CML的治療效率。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，我們首先構(gòu)建了P15INK4b慢病毒表達(dá)載體，通過RT-PCR方法

7、從人外周單個(gè)核細(xì)胞中擴(kuò)增P15INK4b基因，經(jīng)純化回收后連接于PCDH-CMV-MCS-EF1-COPGFP載體上構(gòu)建P15INK4b慢病毒表達(dá)載體。然后對(duì)P15INK4b基因進(jìn)行慢病毒包裝，制備P15INK4b的病毒顆粒感染K562細(xì)胞，使其穩(wěn)定表達(dá)P15INK4b基因。其次，構(gòu)建Bcr-abl siRNA，采用熒光素酶基因(基因序號(hào) M15077,394414)作為非特異性對(duì)照,將 Bcr-abl siRNA轉(zhuǎn)染 K562細(xì)胞抑制

8、P210bcr-abl的表達(dá)。同時(shí)，結(jié)合對(duì)STI571的研究，通過排列組合的方式，觀察STI571，P15INK4b慢病毒感染和Bcr-abl siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合作用后對(duì)K562細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等的影響，為指導(dǎo)CML的治療提供新的理論基礎(chǔ)。
　　1. P15INK4b慢病毒載體構(gòu)建及病毒滴度測(cè)定
　　P15INK4b慢病毒表達(dá)載體經(jīng)慢病毒包裝后，經(jīng)逐孔稀釋法測(cè)定病毒的滴度為2×108U/ml。P15INK4b慢病

9、毒感染可顯著抑制K562細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　2.Bcr-abl特異性siRNA可顯著抑制K562細(xì)胞增殖，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，且具有明顯的誘導(dǎo)凋亡的作用；
　　本研究發(fā)現(xiàn)Bcr-abl siRNA轉(zhuǎn)染可顯著抑制K562細(xì)胞內(nèi)P210bcr-abl蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染48h時(shí)，抑制率約為85%。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，Bcr-abl siRNA轉(zhuǎn)染可在24-96h內(nèi)顯著抑制K562細(xì)胞的增殖，在48h時(shí)，可

10、顯著阻滯細(xì)胞周期，使處于G1期的細(xì)胞比例明顯增加，并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)。
　　3.P15INK4b慢病毒感染聯(lián)合Bcr-bal siRNA或STI571對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制作用明顯加強(qiáng)
　　細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，P15INK4b慢病毒感染，Bcr-abl siRNA轉(zhuǎn)染或STI571單獨(dú)應(yīng)用均可顯著抑制K562細(xì)胞的增殖率，且呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性。P15INK4b慢病毒感染+Bcr-abl抑制抑制效率顯著高于兩者單獨(dú)應(yīng)用；

11、P15INK4b感染+STI571抑制效率顯著高于兩者單獨(dú)應(yīng)用，Bcr-abl抑制+STI571抑制抑制效率顯著高于兩者單獨(dú)應(yīng)用，上述結(jié)果提示我們P15INK4b慢病毒感染聯(lián)合Bcr-abl抑制可顯著提升對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制率。
　　4.P15INK4b慢病毒感染聯(lián)合Bcr-bal siRNA或STI571對(duì)K562細(xì)胞周期的影響
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，P15INK4b慢病毒感染可顯著提高G1期細(xì)胞比率，降低S期細(xì)

12、胞比率，表明P15INK4b表達(dá)可延緩DNA復(fù)制。P15INK4b表達(dá)與Bcr-abl抑制或STI571聯(lián)合應(yīng)用可顯著增加處于G1期的細(xì)胞比率，提示P15INK4b與Bcr-abl抑制或STI571聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制DNA的復(fù)制，降低細(xì)胞增殖速率。機(jī)制分析顯示與單獨(dú)治療組相比，聯(lián)合治療組可顯著抑制Cyclin D1和CDK4的表達(dá)，上述結(jié)果提示我們，聯(lián)合治療可顯著抑制細(xì)胞周期依賴蛋白或激酶的表達(dá)，從而發(fā)揮阻滯細(xì)胞周期的作用。
　　

13、5. P15INK4b聯(lián)合Bcr-bal siRNA或STI571對(duì)K562凋亡的影響
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空載體組相比，P15INK4b慢病毒感染可顯著提高細(xì)胞凋亡率，表現(xiàn)為Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞比率的增加。Bcr-abl siRNA轉(zhuǎn)染和STI571亦有相似的作用。P15INK4b與Bcr-abl抑制或STI571聯(lián)合應(yīng)用可顯著增加細(xì)胞凋亡率，提示P15INK4b與Bcr-abl抑制或STI571聯(lián)合應(yīng)用可顯著促

14、進(jìn)K562細(xì)胞凋亡。機(jī)制分析顯示，聯(lián)合治療組可顯著提升Bax/Bcl-2的比值。
　　結(jié)論：酪氨酸激酶抑制劑在CML的治療中發(fā)揮了重要的作用，尤其是STI571的問世，大大提高了CML患者的生存時(shí)間和生存率。但是，隨著STI571的大規(guī)模使用，STI571耐藥性的問題凸顯，這就要求我們?cè)谝种艬cr-abl的同時(shí)，探尋新的治療靶點(diǎn)以提高CML的治療效果。P15INK4b作為經(jīng)典的腫瘤抑制因子，具有抑制細(xì)胞周期蛋白激酶的功效。我們的研