HBV cccDNA定量檢測(cè)方法的建立及臨床初步應(yīng)用.pdf

1、研究分為兩個(gè)部分： 一、HBV cccDNA定量檢測(cè)方法的建立 目的：建立一種特異性、敏感性高的乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（HBVcccDNA）的定量檢測(cè)方法。 方法：構(gòu)建含HBV目的序列的重組質(zhì)粒，利用HBV cccDNA的選擇性引物/探針（簡(jiǎn)稱71F）以及總HBV DNA引物/探針（簡(jiǎn)稱13F）建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，分析其靈敏度、重復(fù)性和線性范圍。進(jìn)一步利用重組質(zhì)粒、血清和肝組織DNA等不同模板優(yōu)

2、選最佳PCR擴(kuò)增體系，其中依據(jù)模板的不同處理方法分為無(wú)酶切組、限制性內(nèi)切酶酶切組、PSAD酶切組、限制性內(nèi)切酶聯(lián)合PSAD酶切組，比較各組對(duì)HBV cccDNA檢測(cè)的特異性。 結(jié)果：通過(guò)對(duì)已有特異性檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，并針對(duì)特異性引物擴(kuò)增效率和PSAD酶切等環(huán)節(jié)進(jìn)行詳細(xì)探討，所建立的熒光定量檢測(cè)體系，HBV cccDNA特異性引物/探針及總HBV DNA引物/探針檢測(cè)靈敏度均達(dá)到102拷貝/ml，兩對(duì)引物探針檢測(cè)線性范圍均為4×1

3、02.4×1011拷貝/mL。熒光定量檢測(cè)體系重復(fù)性批內(nèi)差：13F與71F CV均<3％；批間差：13F CV<4％，71F CV<3％。對(duì)質(zhì)粒和臨床樣本定量檢測(cè)結(jié)果證實(shí)13F、71F與商業(yè)試劑盒之間具有相同的擴(kuò)增效率，在保證定量結(jié)果僅與樣本DNA含量相關(guān)前提下，根據(jù)各組間比較，顯示血清應(yīng)用PSAD酶切再應(yīng)用特異性引物探針擴(kuò)增的方法定量檢測(cè)HBV cccDNA結(jié)果最為特異，可降低4個(gè)log值的非特異擴(kuò)增；肝組織應(yīng)用MluI與PSAD聯(lián)合

4、酶切，再應(yīng)用特異性引物探針擴(kuò)增的方法定量檢測(cè)HBV cccDNA結(jié)果最為特異，可降低5個(gè)log值的非特異擴(kuò)增。 結(jié)論：建立一種新的樣本處理方法，可以進(jìn)一步提高HBV cccDNA檢測(cè)特異性，構(gòu)建一種特異性、靈敏性較好的HBV cccDNA定量檢測(cè)方法。 二、乙肝病毒在慢性HBV感染者疾病不同階段復(fù)制特點(diǎn) 目的：研究慢性乙型肝炎（CHB）、乙肝肝硬變（LC）、乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌（HCC）患者血清和肝組織中總HBV

5、 DNA、HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（HBV cccDNA）分布及其與其它臨床指標(biāo)關(guān)系，分析疾病不同階段狀態(tài)病毒復(fù)制特點(diǎn)及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系。 方法：應(yīng)用熒光定量PCR方法對(duì)21例慢性乙型肝炎、23例乙肝肝硬變、25例乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌患者血清和肝組織樣本總HBV DNA及HBV cccDNA進(jìn)行定量檢測(cè)。 結(jié)果：血清總HBV DNA、肝組織總HBV DNA、肝組織HBV cccDNA以及肝組織HBV cccDNA占總H

6、BV DNA比例在慢性乙型肝炎、乙肝肝硬變、乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌患者中呈降低趨勢(shì)，其中慢性乙型肝炎與原發(fā)性肝癌患者血清總HBV DNA、肝組織總HBV DNA差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.05）；慢性乙型肝炎、乙肝肝硬變患者肝組織HBV cccDNA及肝組織HBV cccDNA占總HBVDNA比例明顯高于原發(fā)性肝癌患者（P值均小于0.01）；血清HBV cccDNA在慢性乙型肝炎、乙肝肝硬變、乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌患者中檢測(cè)均陰性。慢

7、性乙型肝炎HBeAg（+）組血清總HBV DNA、肝組織總HBV DNA、肝組織HBV cccDNA均明顯高于HBeAg（-）組（P值均小于0.01）；乙肝肝硬變HBeAg（+）組肝組織總HBVDNA及肝組織HBV cccDNA明顯高于HBeAg（-）組（P值均小于0.05），血清總HBVDNA前者雖高于后者但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌患者血清總HBVDNA、肝組織總HBV DNA、肝組織王HBV cccDNA雖HBeAg（+）

8、組高于HBeAg（-）組，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血清總HBV DNA、肝組織總HBV DNA、肝組織HBVcccDNA三者間相關(guān)性在慢性乙型肝炎、乙肝肝硬變、乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌呈減弱趨勢(shì)，而血清總HBV DNA、肝組織總HBV DNA、肝組織HBV cccDNA與ALT、TBIL在上述疾病三個(gè)階段均無(wú)相關(guān)性。 結(jié)論：慢性乙型肝炎、乙肝肝硬變、原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)病毒復(fù)制活性逐漸減低，但乙肝肝硬變與慢性乙型肝炎患者病毒復(fù)制無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別