APP轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及人參皂苷Rb1的治療作用研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種以記憶減退、認(rèn)知障礙以及人格改變等為臨床特征的進(jìn)行性癡呆，以大腦皮層和海馬區(qū)域出現(xiàn)老年斑（senile plaques，SP）、神經(jīng)元纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangle，NFT）和營養(yǎng)不良性軸突的改變?yōu)椴±硖卣鞯睦夏晟窠?jīng)變性。SP由β淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）在細(xì)胞外沉積造成，NFT主要成分是過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau。

2、Aβ沉積和tau蛋白異常磷酸化是導(dǎo)致AD神經(jīng)元喪失及產(chǎn)生癡呆癥狀的重要因素。但是這些病理變化常常在患者死亡后尸體解剖才得以證實(shí)，而在患者的青年時(shí)期或發(fā)病早期神經(jīng)系統(tǒng)的病變機(jī)制尚不清楚，也使得AD患者難以進(jìn)行早期治療和療效欠佳。
　　 阿爾茨海默病的患病率隨年齡增長(zhǎng)而上升，且有明顯的遺傳傾向。資料顯示，大約30％的阿爾茨海默病患者有家族遺傳性（稱為家族性阿爾茨海默病，F(xiàn)AD），提示AD的發(fā)病是一個(gè)漫長(zhǎng)的漸變過程。但在這個(gè)過程中，神

3、經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)和病理改變十分不清，尤其是那些攜帶有致病基因的神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）、神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和生長(zhǎng)的生物學(xué)特性尚待研究。
　　 利用人腦NSCs或神經(jīng)細(xì)胞來研究不同發(fā)育時(shí)期AD的病理特征和治療方案不僅取材困難，而且受著倫理道德的限制。復(fù)制AD的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，可以很好地克服這些問題。目前國際公認(rèn)APP轉(zhuǎn)基因小鼠是最佳AD動(dòng)物模型。APP轉(zhuǎn)基因小鼠是根據(jù)分子遺傳學(xué)和胚胎學(xué)理論和技術(shù)，

4、利用顯微注射的方法將 APP基因片段整合入小鼠的基因組中，使得小鼠腦內(nèi)表達(dá)人淀粉樣前蛋白（amyloidprecursor protein，APP）基因，通過APP蛋白在大腦中過量表達(dá)，導(dǎo)致AB產(chǎn)生增加，產(chǎn)生老年斑，從而造成小鼠老年性癡呆轉(zhuǎn)基因模型。該模型為研究APP代謝、AD的發(fā)生和發(fā)展及藥物對(duì)發(fā)病進(jìn)程的干預(yù)提供了良好的研究基礎(chǔ)。
　　 抑制Aβ沉積和tau蛋白異常磷酸化是治療AD最根本的措施之一。目前AD的傳統(tǒng)治療措施主要采

5、用作用于膽堿能系統(tǒng)的藥物、雌激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、非甾體抗炎藥、抗氧化劑、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體拮抗劑、抗Aβ藥物、改善腦代謝的藥物等，但對(duì)AD均無滿意的效果。我們推測(cè)這可能至少有兩方面的原因：一是AD的發(fā)病機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討，二是需要探索新的治療藥物和治療時(shí)機(jī)。雖然已有報(bào)道表明，乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的變化在AD的發(fā)病過程中起重要作用、但是中樞眾多的遞質(zhì)改變尚不清楚，尤其是氨基酸類

6、中樞遞質(zhì)和組胺遞質(zhì)在AD中的變化無人研究。因此，本研究首先采用 APP轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象，通過在體內(nèi)外的研究探索APP轉(zhuǎn)基因小鼠在發(fā)育過程中，神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育特征和中樞氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)、組胺的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步揭示AD的發(fā)病機(jī)制。
　　 中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)、多層次的整合效應(yīng)，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)的優(yōu)勢(shì)可能為治療AD找到的有效藥物。人參皂苷Rb1是人參和西洋參的主要成分之一，具有廣泛的生理活性和藥用價(jià)值，具有促智、抗氧化、提高免

7、疫力和增強(qiáng)記憶力等作用，尤其是在改善學(xué)習(xí)記憶能力和保護(hù)神經(jīng)方面有很好的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期的體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)人參皂苷Rb1可以改善Aβ25-35導(dǎo)致的 Tau蛋白過磷酸化，也有一些研究報(bào)道了人參皂苷Rb1對(duì)Aβ生成、代謝的影響，但所采用的AD模型大多為鋁制劑、半乳糖、Aβ等誘導(dǎo)，不僅不能較好地模擬體內(nèi)病理改變，而且還缺乏系統(tǒng)研究，尤其是對(duì)氨基酸類中樞遞質(zhì)和組胺遞質(zhì)的影響未見報(bào)道。因此，本研究在APP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，探索了Rb1對(duì)AD動(dòng)

8、物行為學(xué)、病理學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)的綜合治療作用，以期為AD的治療尋求一條有效的途徑。
　　 第一部分 APP轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究。
　　 第二部分人參皂苷Rb1對(duì)體外培養(yǎng)APP轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的影響及機(jī)制研究。
　　 第三部分 APP轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病過程中腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和組織病理學(xué)特征的研究。
　　 第四部分人參皂苷Rb1對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠的治療作用和機(jī)制研究。
　　 結(jié)

9、論:
　　 1.APP高表達(dá)不影響體外培養(yǎng)的NSCs的生長(zhǎng)速度和細(xì)胞形態(tài)，但可引起NSCs誘導(dǎo)分化后的總Tau的表達(dá)量增高，細(xì)胞凋亡率增高，APP+新生鼠神經(jīng)干細(xì)胞可作為AD發(fā)病機(jī)制和抗AD藥物篩選研究的理想細(xì)胞模型。
　　 2.人參皂苷Rb1降低體外培養(yǎng)的APP+鼠NSCs分化細(xì)胞的Tau蛋白396和262位點(diǎn)的磷酸化水平，人參皂苷Rb1可上調(diào)GSK-38的表達(dá)和下調(diào)PP2A的表達(dá)而影響Tau蛋白磷酸化水平。
　

10、　 3.APP+鼠的中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量和酶表達(dá)量與APP-鼠存在明顯差異，表現(xiàn)在：APP+鼠中樞組胺含量和HNMT表達(dá)量明顯升高；APP+鼠AchE活性明顯低于APP-鼠，不同月齡APP+鼠AchE活性不同（6和12月齡較低，9月齡較高）；氨基酸類遞質(zhì)谷氨酸（Glu），γ-氨基丁酸（GABA），?；撬岷繜o明顯變化，APP+鼠甘氨酸（Gly）含量明顯高于APP-鼠。
　　 4.人參皂苷Rb1可改善APP模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；降