人呼吸道合胞病毒(HRSV)低溫傳代株穩(wěn)定性的研究.pdf

1、本研究課題目的是分析HRSV A2株經低溫培養(yǎng)傳代后毒力改變的情況及穩(wěn)定性檢測，為疫苗的開發(fā)做基礎研究。實驗內容主要包括：HRSV在KMB17上于32℃連續(xù)傳代、低溫傳代株遺傳穩(wěn)定性檢測、在不同溫度及物理條件下HRSV穩(wěn)定性的觀察及核酸熒光染色法觀察HRSV合胞現(xiàn)象。 HRSV在KMB17上于32℃連續(xù)傳代已至35代，病毒培養(yǎng)增殖時間在7—10天左右，感染性滴度在7.0-7.5 lgCCID50/ml之間，表明HRSV已慢慢適

2、應KMB17細胞，為培養(yǎng)細胞基質的更換(使用二倍體細胞培養(yǎng)病毒)及減毒株的篩選奠定良好基礎。 遺傳穩(wěn)定性觀察包括：一步生長曲線、免疫原性及核酸序列檢測。本實驗對低溫培養(yǎng)的第5、19、28和34代做了一步生長曲線觀察，結果表明HRSV在低溫下的適應性，即低溫傳代代次較高的病毒在32℃病變時間越來越短，感染性滴度也越來越高，至34、35代時感染性滴度已穩(wěn)定在7.5lgCCID50/ml。另外，實驗選擇經低溫培養(yǎng)的第21和26代病毒進

3、行動物實驗，檢測其免疫原性。結果顯示，低溫傳代的HRSV減毒程度還不夠，仍能致靶器官組織產生明顯炎癥及間質性肺炎；且抗原性不強，誘導機體產生的中和抗體效價約為1：2—1：8。最后實驗對低溫培養(yǎng)的不同代次病毒進行了G蛋白基因核酸序列測定，通過對低溫傳代株P15、P20、P25的序列比對，未發(fā)現(xiàn)編碼G蛋白基因發(fā)生變異。 HRSV在不同溫度保存及物理條件處理后穩(wěn)定性觀察，結果顯示HRSV穩(wěn)定性較差，在37℃和室溫下保存都不穩(wěn)定，感染

4、性滴度每天分別下降1.0-2.0 lgCCID50/ml和0.2-0.8 lgCCID50/ml；在4℃下感染性滴度下降較慢，存放5周之后，病毒滴度變化<0.6 lgCCID50/ml，可短暫保存；—20℃保存3個月后滴度僅下降0.5 lgCCID50/ml，為保證感染性滴度穩(wěn)定HRSV需保存于—20℃或更低溫度。HRSV在凍融之后，病毒感染性滴度呈明顯下降趨勢，每凍融1次，病毒感染性滴度下降約1.30 lgCCID50/ml。經超聲波

5、處理后，HRSV病毒感染性滴度下降更快，超聲處理2次后，病毒幾乎無感染性。 鑒于HRSV穩(wěn)定性差，實驗在病毒液中加入保護劑后觀察了滴度下降的情況。結果顯示，保護劑對病毒熱不穩(wěn)定性和凍融不穩(wěn)定性均起到穩(wěn)定作用。 核酸熒光染色法觀察HRSV在幾種細胞上的合胞體現(xiàn)象。其中Hep—2細胞是HRSV病變最快的細胞，在培養(yǎng)24h后，可看見合胞現(xiàn)象；Vero細胞病變時間次之，KMB17細胞最慢，且病變形態(tài)不同于前兩者。可能與病毒對細胞