重組人腸三葉因子對(duì)燒傷后腸道免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察重組人腸三葉因子（recombinant human intestinal trefoil factor, rhITF)對(duì)燒傷后腸道免疫功能的影響并探討其可能的機(jī)制。
　　方法：本課題分為體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。體外實(shí)驗(yàn)采用大鼠小腸上皮細(xì)胞株（intestinal epithelial cells，IEC-6)傳代培養(yǎng)模型，在正常IEC-6和燒傷血清損傷的IEC-6兩個(gè)層面觀察ITF對(duì)其免疫功能的影響。在第一層面，將

2、細(xì)胞分為正常對(duì)照（control，C）組、rhITF（I）組、黏蛋白（mucin，M）組和rhITF加黏蛋白（I+M）組，培養(yǎng)條件分別為常規(guī)培養(yǎng)（DMEM+10％小牛血清）、常規(guī)培養(yǎng)+25μg/ml rhITF、常規(guī)培養(yǎng)+250μg/ml黏蛋白以及常規(guī)培養(yǎng)+25μg/ml rhITF+250μg/ml黏蛋白。在第二層面，將細(xì)胞分為燒傷對(duì)照（burn，B）組、燒傷加rhITF（B+I）組、燒傷加黏蛋白（B+M）組和燒傷加rhITF和黏蛋白

3、（B+I+M）組，培養(yǎng)條件與上述4組類似，不同之處是用10%燒傷大鼠血清替換10%小牛血清，其他條件不變。分別采用瑞氏吉姆薩染色法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和放射免疫法觀察IEC與大腸桿菌黏附數(shù)量、細(xì)胞存活率以及分泌炎性介質(zhì)能力的變化。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將102只BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（C）組，燒傷對(duì)照（B）組、rhITF低劑量（1 mg/kg）組、rhITF中劑量（2.5 mg/kg）組和rhITF高劑量
　?。? mg/kg）組

4、。C組只給予麻醉和剃毛，不予燒傷，其他4組小鼠給予80℃水浴燙傷20s，造成30%體表面積Ⅲ度燙傷。ITF治療組依據(jù)上述劑量每天分兩次口服灌胃給藥，B組灌胃等量生理鹽水。觀察時(shí)相為傷后1、3、5、7天，每組每時(shí)相6只小鼠。另外比較了縱切剪片法、黏膜刮取法和腸道翻轉(zhuǎn)法三種處理方式分離腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intra epithelial lymphoeyte, IEL）的優(yōu)劣，最終采用縱切剪片法分離、純化IEL，并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)TCRγδ

5、+IEL和TCRαβ+IEL細(xì)胞比例，分析燒傷后IEL亞型變化規(guī)律及ITF對(duì)其的影響。
　　結(jié)果：1．體外實(shí)驗(yàn)：（1）在燒傷血清的刺激下，B組IEC黏附細(xì)菌數(shù)量明顯高于C組（P<0.01）；與B組相比，B+I組和B+M組細(xì)菌黏附數(shù)量在0.5 h、1 h、明顯降低(P<0.05或P<0.01）；聯(lián)合用藥的B+I+M組不僅在各時(shí)相點(diǎn)明顯低于B組(P<0.01），在2 h和3 h明顯低于B+I和B+M組(P<0.05或P<0.01)。<

6、br>　?。?） rh ITF和黏蛋白能增加燒傷血清刺激后IEC存活率，B+I組在作用1 h和2 h，B+M組在作用0.25 h和0.5 h時(shí)，細(xì)胞存活率明顯高于B組（P<0.05或P<0.01）；聯(lián)合用藥效果更佳，B+I+M組不僅明顯高于B組（P<0.05或P<0.01），也明顯高于另外兩組。（3）在燒傷血清刺激下IEC分泌炎性介質(zhì)（TNF-α、IL-6和IL-8）的能力明顯增加（P<0.01）。給予rhITF能顯著降低IEC分泌炎性

7、介質(zhì)的能力，其分泌量明顯低于B組（P<0.05或P<0.01）；B+M組與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B+I+M組在各時(shí)相點(diǎn)不僅顯著低于B組（P<0.01），也明顯低于B+I組（P<0.05）。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：(1)通過比較獲取細(xì)胞數(shù)量、純度和活性以及耗時(shí)等4個(gè)方面的優(yōu)劣，明確了縱切剪片法最優(yōu)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用該方法分離IEL。(2)燒傷后腸道IEL亞型發(fā)生明顯變化，與C組相比，B組小鼠腸道TCRγδ+IEL比例

8、明顯降低，而TCRαβ+IEL比例明顯增加（P<0.05）。（3）給予不同劑量的rhITF能增加TCRγδ+IEL比例，同時(shí)降低TCRαβ+IEL比例，保持二者的平衡；在燒傷后1-7天都明顯優(yōu)于B組（P<0.05或P<0.01）且應(yīng)用rhITF的最小有效劑量為1mg/kg。
　　結(jié)論：（1）rh ITF能增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞抵御細(xì)菌黏附的能力，降低細(xì)胞死亡率，并能減輕燒傷血清的免疫刺激作用，維護(hù)腸上皮細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)，減少炎癥介質(zhì)釋放。黏蛋