小鼠甘露聚糖結(jié)合凝集素（mMBL-A、mMBL-C）的克隆與表達(dá)及其功能研究.pdf

1、甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannanbindinglectin，MBL)為肝細(xì)胞分泌的一種血漿糖蛋白，屬于C型凝集素超家族中膠凝素家族的成員，是天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識別分子。成熟MBL肽鏈自N端至C端依次有4個(gè)結(jié)構(gòu)域：富含Cys的N端區(qū)、膠原樣區(qū)(collagen-likeregion，CLR)、頸區(qū)和C端糖識別域(carbohydrate-recognitiondomain，CRD)。MBL在機(jī)體抗感染天然免疫中起重要作用。它利用CR

2、D選擇性識別和結(jié)合多種病原體如細(xì)菌、病毒、酵母、利什曼原蟲表面的糖結(jié)構(gòu)，又藉其CLR經(jīng)由凝集素途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，發(fā)揮溶菌或間接調(diào)理吞噬功能，還能與吞噬細(xì)胞表面的膠凝素受體(即C1q受體)結(jié)合，起直接調(diào)理作用。然而，認(rèn)識對MBL結(jié)構(gòu)與功能有一些了解，但MBL分子的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系及其生物學(xué)功能與機(jī)制亟待探索。 人類的MBL只有一種成分，而大鼠、小鼠、家兔和恒河猴體內(nèi)存在2種不同形式的MBL分子，即血清型(MBL-A)和肝型(MBL-

3、C)。膠凝素家族成員在進(jìn)化過程中高度保守，小鼠MBL(mMBL)與人MBL(hMBL)在氨基酸水平上具有很高的同源性。鑒于mMBL與hMBL結(jié)構(gòu)的高度同源性及其在分布、生物學(xué)活性方面的諸多相似，小鼠無疑是研究MBL結(jié)構(gòu)、功能及其機(jī)制的良好模型。 第1章Balb/C小鼠MBL基因的克隆 根據(jù)已發(fā)表的mMBL的cDNA序列，采用Primerpremier5.0軟件，設(shè)計(jì)并合成2對引物。以Balb/C小鼠肝臟cDNA為模板進(jìn)行

4、PCR，得到小鼠MBL基因cDNA片段，克隆入pUCm-T載體，PCR鑒定并測序。陽性質(zhì)粒分別命名為pmMBL-A和pmMBL-C。序列分析發(fā)現(xiàn)：pmMBL-C與已發(fā)表序列完全相同；pmMBL-A與已發(fā)表序列僅1個(gè)堿基不同(其426位堿基由A變?yōu)镚)，兩者的同源性達(dá)99.9％。結(jié)果表明我們成功獲取了小鼠MBL基因，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。 第2章小鼠MBL糖識別域的原核表達(dá)和相關(guān)抗體的制備 分別表達(dá)小鼠MBL-A和MB

5、L-C的CRD，并制備相關(guān)抗體。(1)利用PCR從含有Balb/C小鼠MBL基因的質(zhì)粒pmMBL-A和pmMBL-C中擴(kuò)增目的基因片段，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-41-mMBL-A-CRD、pET-CKS-mMBL-C-CRD和pET32a-mMBL-C-CRD，將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中得到表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，其相對分子質(zhì)量(Mr)分別為47000、44000和34000。用梯度透析法進(jìn)行復(fù)性，然后純化蛋白

6、，以ELISA鑒定表達(dá)蛋白具有糖結(jié)合活性。(2)對小鼠MBL-A的B細(xì)胞優(yōu)勢表位進(jìn)行預(yù)測，合成B細(xì)胞識別表位短肽，將其與載體蛋白交聯(lián)制備免疫原，免疫家兔獲得相應(yīng)抗血清，經(jīng)ELISA檢測其滴度為1∶256000。采用SPG柱對所得抗血清進(jìn)行純化，ELISA分析顯示所得抗體可與mMBL-ACRD重組蛋白結(jié)合。(3)利用pET-CKS-mMBL-C-CRD的表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔，分離血清后，以pET32a-mMBL-C-CRD表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行ELIS

7、A，其抗體滴度為1∶256000，采用親和層析對所得抗血清進(jìn)行純化，Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多克隆抗體能夠與mMBL-CCRD蛋白特異性結(jié)合。 第3章mMBL-C抑制痢疾桿菌侵襲小腸黏膜的研究 通過ELISA方法鑒定重組mMBL-CCRD蛋白與福氏痢疾桿菌2a裂解物的結(jié)合，以FITC和TRITC分別標(biāo)記重組mMBL-CCRD蛋白和痢疾桿菌進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)觀察重組蛋白與細(xì)菌的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)重組CRD蛋白可與痢疾桿菌及其裂

8、解物結(jié)合，該作用是Ca2+依賴的，且抗mMBL-CCRD多克隆抗體能阻斷mMBL-CCRD蛋白與痢疾桿菌的結(jié)合。 用2×1011個(gè)具鏈霉素耐藥性的痢疾桿菌2a經(jīng)口服攻擊小鼠，建立小鼠腸道細(xì)菌感染模型。感染前2d，經(jīng)口服給予小鼠5mg硫酸鏈霉素和1mg紅霉素并禁食1d，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中喂食含4g/L硫酸鏈霉素的純水。攻擊前2h，通過靜脈注射和口服2種途徑分別給予小鼠抗mMBL-CCRD多克隆抗體各0.2mg以阻斷mMBL-C與痢疾