人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和人羊膜上皮細(xì)胞對大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎治療效應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖卟　Ｄ壳吧袩o根治方法。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)和人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)具有免疫調(diào)節(jié)作用,為治療MS提供了可能。本研究以大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓(EAE)作為MS的模型,觀察hAMSCs和hAECs的治療效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:①采用胰酶-膠原酶兩步消化法分離培養(yǎng)hAMSCs、hAECs細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和免疫組化進(jìn)行鑒定。②

2、采用豚鼠脊髓勻漿+完全弗氏佐劑(CFA)+百日咳毒素(PTx)復(fù)制EAE大鼠模型。成模動物隨機(jī)分為模型組(n=12)、培養(yǎng)基組(n＝6)、hAMSCs治療組(n=12)、hAECs治療組(n=12)和潑尼松治療組(n＝12)。另設(shè)正常組(n=6)作為平行對照。細(xì)胞治療組經(jīng)雙側(cè)側(cè)腦室注射hAMSCs或hAECs懸液10μl/只（含5×105個細(xì)胞）,培養(yǎng)基組同樣的途徑注射等體積無血清的L-DMEM培養(yǎng)基,藥物治療組腹腔注射潑尼松25mg/

3、(kg.d)連續(xù)一周。③動態(tài)觀察動物體重變化,采用kono評分觀察行為學(xué)改變。④HE染色觀察大鼠腦和脊髓組織病理改變。⑤細(xì)胞移植后3周和5周,免疫熒光染色示蹤供體細(xì)胞在腦和脊髓組織內(nèi)的分布。⑥細(xì)胞移植后3周和5周,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測大鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1和Tc2 T淋巴細(xì)胞亞群變化。⑦流式微球芯片捕獲技術(shù)(CBA)檢測血漿細(xì)胞因子IFN-γ、 TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10的含量。

4、　　 結(jié)果:①第3代hAMSCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105及波形蛋白陽性,不表達(dá)CD14、CD19、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR;第三代hAECs表達(dá)CD29、CD44、CD73及CK19陽性,不表達(dá)CD34、CD45、CD71、CD80、CD86和HLA-DR。②hAMSCs和hAECs治療組分別于移植后第5天和第3天開始至觀察期結(jié)束,kono評分均明顯低于模型組和培養(yǎng)基組(P＜0.05;

5、P＜0.01);第20天至第35天,hAECs組kono評分明顯低于hAMSCs組(P＜0.05;P＜0.01);第14天至第35天,hAECs組kono評分明顯低于潑尼松組(P＜0.05; P＜0.01)。③與正常組大鼠比較,各組大鼠體重不同程度下降,但hAMSCs和hAECs治療組從移植后9天起,動物體重止降啟穩(wěn),至第5周漸增至移植時體重水平,且明顯高于模型組、培養(yǎng)基組和潑尼松組（均P＜0.05）。④病理檢查可見hAMSCs和hAE

6、Cs治療組腦和脊髓炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。⑤免疫熒光染色結(jié)果顯示,hAMSCs組和hAECs組移植后3周和5周,腦和脊髓組織中均有較多人細(xì)胞核抗原陽性即hAMSCs和hAECs存活。⑥FCM分析結(jié)果顯示,與模型組比較, hAMSCs治療組、hAECs治療組和潑尼松組Th2、Tc1（CD4-CD8+IFN-γ+）、Tc2(CD4-CD8+IL-4+)和Treg細(xì)胞百分率均明顯升高（P＜0.05; P＜0.01）,而Th17顯著下降(均P＜0

7、.01),Th1/Th2和Th17/Treg比值均降低(P＜0.05;P＜0.01);hAMSCs組和hAECs組比較,后者Th1細(xì)胞下降和Treg細(xì)胞升高更為顯著(P＜0.05); hAMSCs組和hAECs組與潑尼松組比較, Th17細(xì)胞下降更明顯(P＜0.01; P＜0.05)。⑦CBA法檢測結(jié)果顯示,與模型組比較,hAMSCs和hAECs治療組第3周和第5周IL-2和IFN-γ含量均明顯降低(P＜0.05;P＜0.01),IL-

8、4和IL-10均顯著升高（P＜0.05;P＜0.01）;與潑尼松組比較,第3周和第5周hAMSCs和hAECs組IL-2的含量均明顯降低（均P＜0.05）,第5周IL-10含量明顯升高(P＜0.05),第5周hAECs組TNF-α明顯減少;hAECs組第5周TNF-α的含量明顯低于hAMSCs組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:hAMSCs和hAECs移植能明顯改善EAE大鼠神經(jīng)功能,其機(jī)制可能主要與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群,尤其與上調(diào)F