羅漢果蛋白酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、羅漢果（Siraitia grosvenorii）是我國特有的植物，主產(chǎn)于廣西桂林，在醫(yī)藥、食品、保健等方面應(yīng)用廣泛，在國內(nèi)外市場(chǎng)都受到極大的歡迎。但目前對(duì)羅漢果的加工利用僅僅局限于果實(shí)中少數(shù)幾種成分，而其它許多有用成分并沒得到充分利用，這既浪費(fèi)了資源又給環(huán)境造成很大污染。此外，蛋白酶是目前工業(yè)用酶的三大主要酶制劑之一，在食品、化工、醫(yī)療、制藥等方面應(yīng)用廣泛。而有限的蛋白酶源與逐年上升的市場(chǎng)需求相比已呈緊缺之勢(shì)，因此有效地開發(fā)新的蛋白酶

2、源已經(jīng)迫在眉睫。 本論文在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)羅漢果蛋白酶的分離純化、性質(zhì)、應(yīng)用以及提取工藝等方面進(jìn)行了深入的研究，以便更全面地了解羅漢果蛋白酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和特點(diǎn)，為開發(fā)新的蛋白酶源和有效地綜合利用我國特有的羅漢果資源提供一定的科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下： 一、羅漢果蛋白酶的分離純化。以鮮羅漢果為原料，經(jīng)洗凈，去皮，粉碎，勻漿，離心去渣，得羅漢果汁，再經(jīng)50％飽和度硫酸銨鹽析，沉淀透析，冷凍干燥得羅漢果粗酶。粗酶

3、通過CM Sepharose FF離子交換、Sepahcryl S-200 HR凝膠過濾、Sepahcryl S-100 HR凝膠過濾柱層析分離，得到純化的羅漢果蛋白酶，再將其進(jìn)行SDS-PAGE和凝膠過濾HPLC分析均顯示單一的蛋白質(zhì)條帶或蛋白質(zhì)峰。純化后蛋白酶的酶比活為9.4×107U/g，與果汁相比蛋白酶活性回收率為4.2％，提純倍數(shù)為31倍。 二、羅漢果蛋白酶的性質(zhì)研究。由分離純化得到的蛋白酶，經(jīng)凝膠HPLC測(cè)定其純度在

4、98％以上，SDS-PAGE和Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析測(cè)定蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為37100D和38200D。蛋白酶的活性在pH12時(shí)最大，可將該酶歸類為堿性蛋白酶。紫外光譜顯示酶在220nm和280nm處有強(qiáng)吸收，推測(cè)在酶分子中可能存在含苯環(huán)側(cè)鏈的氨基酸殘基。其它酶活性測(cè)定顯示該酶不具有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、過氧化物酶、淀粉酶及脂肪酶活性。此外，大豆胰蛋白酶抑制劑不能抑制該蛋白酶的活性，這也說明該蛋白酶不屬于

5、胰蛋白酶。為了探索羅漢果蛋白酶活性所必需的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，實(shí)驗(yàn)用對(duì)不同的氨基酸殘基有專一性作用的各種化學(xué)修飾劑與羅漢果蛋白酶反應(yīng)，結(jié)果顯示羥基、吲哚基和咪唑基的修飾對(duì)羅漢果蛋白酶活性有很大的抑制作用。進(jìn)一步用酪蛋白作底物保護(hù)蛋白酶中的羥基、吲哚基和咪唑基，以使它們不被修飾，結(jié)果顯示蛋白酶活性與保護(hù)前的酶活性相比有很大的提高。由此確定羥基、吲哚基和咪唑基參與了羅漢果蛋白酶和酪蛋白底物的結(jié)合，為羅漢果蛋白酶的活性必需基團(tuán)。 三、金屬

6、離子、化學(xué)試劑和表面活性劑對(duì)蛋白酶活性的影響。在常見金屬離子中，Cu2+ 對(duì)蛋白酶活性影響最大，5mmol/L的Cu2+能使酶活性降低到原來的25.8％，此外Al3+、Ni2+、Mn2+也能部分抑制該酶的活性，而其它金屬離子對(duì)酶活性沒有大的影響，相反Fe3+和Mg2+能激活酶的活性。 0.02％的SDS 和0.1％的Triton X-100、吐溫80、聚乙二醇和乙二醇對(duì)有酶活性有不同的抑制作用，其中0.01％Triton X-1

7、00對(duì)該酶活性影響最大，作用后活性僅保留57％；Na2B4O7?10H2O對(duì)酶活性有很大的增強(qiáng)，作用后使酶活性提高0.86倍，其它常見化學(xué)試劑和表面活性劑或增稠劑對(duì)酶活性沒有明顯的影響。 四、羅漢果蛋白酶的對(duì)其它蛋白質(zhì)的水解作用和儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)酪蛋白有很好的底物專一性相比，羅漢果蛋白酶幾乎不水解牛白蛋白、卵蛋白和胰蛋白，但對(duì)明膠、溶菌酶有一定的水解活性。 羅漢果蛋白酶的穩(wěn)定性研究表明，干燥、避光、低溫

8、儲(chǔ)存和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％半胱氨酸的添加都有利于羅漢果蛋白酶的穩(wěn)定，20％的葡萄糖對(duì)儲(chǔ)存三個(gè)星期后羅漢果蛋白酶的穩(wěn)定有很好的保護(hù)作用。EDTA對(duì)羅漢果蛋白酶活性有一定抑制作用，但在儲(chǔ)存75天后對(duì)酶活性有一定的穩(wěn)定作用，以1％的濃度效果更佳。 五、羅漢果蛋白酶的提取工藝研究。以廣西融安和荔蒲的不同生長(zhǎng)期的鮮羅漢果為研究對(duì)象，羅漢果所含的蛋白質(zhì)和蛋白酶活性隨著生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在一定的時(shí)間都有一個(gè)峰值，表現(xiàn)在不同的生長(zhǎng)期，然后逐漸下將

9、，而蛋白酶的比活力并沒表現(xiàn)出明顯的規(guī)律。 新鮮羅漢果經(jīng)洗凈，破碎，水提，離心去渣，得到羅漢果汁，再經(jīng)100nm陶瓷膜過濾和10,000D有機(jī)膜分離后，收集截留液經(jīng)噴霧干燥得到產(chǎn)品羅漢果粗酶。經(jīng)測(cè)定：與果汁相比，羅漢果蛋白酶活性回收率為45.4％，提純倍數(shù)為2.67倍，濃縮了近6倍，噴霧干燥后酶活性沒有明顯變化。該工藝簡(jiǎn)單易行，分離快速，濃縮度和酶活性回收率都較高，對(duì)羅漢果蛋白酶的大規(guī)模生產(chǎn)和羅漢果的綜合開發(fā)利用提供了一定的參考價(jià)