Wnt-1信號(hào)通路靶蛋白(WISP-1)各結(jié)構(gòu)域蛋白的原核表達(dá)、純化及可能介導(dǎo)食管癌放療抵抗的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域蛋白的噬菌體文庫篩選.pdf

1、目的:
　　采用基因克隆表達(dá)技術(shù)，使用pFN19A(HaloTag(R)) T7 SP6 Flexi載體，分別構(gòu)建WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白的pFN19A(HaloTag7)T7 SP6 Flexi載體，分別標(biāo)記為pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK，含有Halo標(biāo)簽的蛋白位于WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白的氨基末端;通過一步法(KRX)感受態(tài)細(xì)胞用于對構(gòu)建好的載體進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化;

2、將誘導(dǎo)表達(dá)的帶有HaloTag的WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白用HaloLink樹脂進(jìn)行高效并特異性的共價(jià)固定，使用TEV蛋白酶從HaloLink樹脂上將WISP-1各結(jié)構(gòu)域蛋白切下，從而使HaloLink樹脂與目的蛋白分離開，這樣就獲得了純度較高的WISP-1各結(jié)構(gòu)域的蛋白，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞層面找到可能介導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生放療抵抗的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，采用噬菌體文庫篩選技術(shù)，篩選出能夠與特定結(jié)構(gòu)域蛋白特異結(jié)合的噬菌體，為后續(xù)研究靶向針對WI

3、SP-1蛋白的藥物多肽奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建并鑒定表達(dá)質(zhì)粒(pFN19A Halo-IGFBP, Halo-VWFC, Halo-TSP, Halo-CTCK):
　　采用基因克隆表達(dá)技術(shù)，采用蛋白質(zhì)編碼序列定向克隆的方法，應(yīng)用VectorNTI10.0生物學(xué)軟件對編碼WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白的cDNA堿基序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，含有Halo標(biāo)簽的原始質(zhì)粒購自美國Promega公司，通過酶切、連接反應(yīng)，將其

4、克隆到表達(dá)質(zhì)粒pFN19A(HaloTag(R)) T7 SP6 Flexi中，構(gòu)建出新的原核表達(dá)質(zhì)粒pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK，并通過菌落PCR，、酶切鑒定、DNA測序，鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒。
　　2.WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域融合蛋白的誘導(dǎo)與純化:
　　將構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)粒pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK

5、轉(zhuǎn)化至感受態(tài)表達(dá)菌KRX中，挑取經(jīng)過驗(yàn)證的單克隆菌加入含有Amp的LB中擴(kuò)增，當(dāng)菌體A值達(dá)到0.4-0.5時(shí)加入鼠李糖至終濃度為0.05％，根據(jù)優(yōu)化后的條件25-37℃誘導(dǎo)過夜，第二天離心沉淀菌體，用蛋白純化液重懸菌體，超聲破菌，按照Halo蛋白純化系統(tǒng)的策略進(jìn)行目的蛋白的純化，得到WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白后采用考馬斯亮藍(lán)及WB對蛋白進(jìn)行鑒定。
　　3.各結(jié)構(gòu)域蛋白對食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-150放療抵抗的初步研究
　　將

6、純化后得到的四個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白分別加入食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-150中，對細(xì)胞進(jìn)行放療并設(shè)置劑量梯度，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)找到對KYSE-150細(xì)胞株發(fā)生放療抵抗的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域蛋白.
　　4.篩選出能夠與關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的噬菌體
　　確定了關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域蛋白后，通過噬菌體篩選技術(shù)，得到可能能夠與關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域蛋白相結(jié)合的噬菌體，采用ELISA法檢測陽性的噬菌體克隆，最終得到能夠與關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域蛋白特異結(jié)合的單克隆噬菌體。
　　結(jié)果:<

7、br>　　1.WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定:
　　菌落PCR、酶切分析、DNA測序等實(shí)驗(yàn)的鑒定結(jié)果與預(yù)期相符，成功構(gòu)建了WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，分別標(biāo)記為:pFN19A Halo-IGFBP，Halo-VWFC, Halo-TSP, Halo-CTCK;
　　2.WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域融合蛋白的誘導(dǎo)與純化:
　　WB和考馬斯亮藍(lán)染色顯示在45kD分子量大小有一特異性的目的條帶

8、，與融合蛋白Halo-IGFBP/VWFC/TSP/CTCK理論分子量相符，說明融合蛋白成功在大腸桿菌KRX中表達(dá);按照Halo蛋白純化系統(tǒng)的策略進(jìn)行目的蛋白的純化，得到WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白后采用考馬斯亮藍(lán)及WB對蛋白進(jìn)行鑒定。
　　3.四個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白與食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-150放療后的克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　將純化后得到的四個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白(IGFBP/VWFC/TSP/CTCK)分別加入食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-150中

9、，對細(xì)胞進(jìn)行放療并設(shè)置劑量梯度，分別為0Gy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)找到WISP-1蛋白介導(dǎo)KYSE-150細(xì)胞株發(fā)生放療抵抗的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域蛋白為WFC.
　　4.與VWFC結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的噬菌體
　　確定了關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域蛋白(VWFC)后，通過噬菌體文庫篩選技術(shù)，得到可能能夠與VWFC結(jié)構(gòu)域蛋白相結(jié)合的噬菌體，采用ELISA法檢測陽性的噬菌體克隆，最終得到了5個(gè)能夠與VWFC結(jié)構(gòu)域蛋白特異結(jié)合的噬菌體

10、單克隆。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了WISP-1四個(gè)結(jié)構(gòu)域融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒(pFN19AHalo-IGFBP，Halo-VWFC，Halo-TSP，Halo-CTCK)，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌KRX中，采用HaloTag蛋白純化系統(tǒng)對目的蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)及WB對蛋白進(jìn)行鑒定，成功獲得了產(chǎn)量大、純度較高并具有功能的WISP-1各結(jié)構(gòu)域的可溶性蛋白，通過克隆形成實(shí)驗(yàn)找到介導(dǎo)放療抵抗的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域蛋白，采用噬