噬菌體展示肽庫(kù)篩選成人骨細(xì)胞特異性結(jié)合多肽的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、以純化的人顱骨成骨細(xì)胞為陽(yáng)性靶細(xì)胞,從噬菌體展示十二肽庫(kù)中篩選出能夠與之特異性結(jié)合的多肽,為鈦種植體表面的生物化修飾提供新的策略和研究方向。
　　第一部分:噬菌體展示十二肽庫(kù)篩選人成骨細(xì)胞特異性多肽的實(shí)驗(yàn)研究
　　以人顱骨成骨細(xì)胞作為靶細(xì)胞,對(duì)噬菌體展示十二肽庫(kù)進(jìn)行全細(xì)胞篩選,洗滌后將獲得的細(xì)胞洗脫液和細(xì)胞裂解液分別培養(yǎng)計(jì)數(shù),經(jīng)四輪篩選后,從計(jì)數(shù)平板中隨機(jī)挑選46個(gè)(洗脫、裂解各23個(gè))分離良好的噬菌體克隆,以人牙齦成纖維細(xì)

2、胞為對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞ELISA檢測(cè)、細(xì)胞免疫熒光等鑒定陽(yáng)性噬菌體克隆并測(cè)序分析。
　　結(jié)果顯示:共得到22個(gè)與成骨細(xì)胞特異性結(jié)合力高于成纖維細(xì)胞2倍以上的陽(yáng)性克隆,氨基酸序列具有同源性。洗脫、裂解液中獲得了共同的特異性結(jié)合多肽,比例相當(dāng),占有相近的結(jié)合優(yōu)勢(shì),這也說(shuō)明與成骨細(xì)胞具有高度親和力的噬菌體是通過(guò)其表面展示的短肽與細(xì)胞特異性結(jié)合,而能夠內(nèi)化入細(xì)胞胞漿內(nèi)的噬菌體也是通過(guò)這種受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)行的。出現(xiàn)頻率最高的多肽氨基酸序列

3、為:MGWSWWPETWPM,對(duì)該多肽序列的氨基酸組成特點(diǎn)及其基本的生化特性進(jìn)行分析。
　　第二部分:噬菌體展示十二肽庫(kù)全細(xì)胞差減篩選人成骨細(xì)胞特異性多肽的實(shí)驗(yàn)研究
　　以人顱骨成骨細(xì)胞作為陽(yáng)性靶細(xì)胞,人牙齦成纖維細(xì)胞為陰性吸附細(xì)胞,對(duì)噬菌體展示十二肽庫(kù)進(jìn)行全細(xì)胞差減篩選,洗滌后將獲得細(xì)胞洗脫液培養(yǎng)計(jì)數(shù),經(jīng)四輪篩選后,從計(jì)數(shù)平板中隨機(jī)挑選30個(gè)噬菌體克隆,分別用人顱骨成骨細(xì)胞和人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞ELISA檢測(cè)、細(xì)胞免疫

4、熒光等鑒定陽(yáng)性噬菌體克隆并測(cè)序分析。其中共得到18個(gè)與成骨細(xì)胞特異性結(jié)合力高于成纖維細(xì)胞2倍以上的陽(yáng)性克隆,其中比值最高者為4.88,取該純化噬菌體樣品(氨基酸序列為VLAVPWSEPGYL)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果顯示:表達(dá)該多肽(氨基酸序列為VLAVPWSEPGYL)的噬菌體克隆可大量聚集結(jié)合在人成骨細(xì)胞表面,在細(xì)胞內(nèi)部呈現(xiàn)點(diǎn)簇狀聚集而發(fā)出綠色熒光,成纖維細(xì)胞綠色熒光暗淡。對(duì)該多肽序列的氨基酸組成特點(diǎn)及其基本的生化特性