DRG MZF1在神經(jīng)病理性疼痛中的作用.pdf

1、研究背景：
　　背根神經(jīng)節(jié)(DRG)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。許多研究證明背根神經(jīng)節(jié)的電壓門(mén)控鉀離子通道(Kv)是決定神經(jīng)元放電頻率和和峰電位持續(xù)時(shí)間的關(guān)鍵因素，Kv1.2屬于Kv1通透型亞型，參與形成Kvα四聚體，在背根神經(jīng)節(jié)中大量表達(dá)。周圍神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型（如CCI模型）中，DRG神經(jīng)元Kv1.2mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)，電流下降，興奮性增強(qiáng)。最近研究發(fā)現(xiàn)，Kv1.2ASRNA（Kv1.2基因的長(zhǎng)

2、鏈非編碼RNA）可負(fù)性調(diào)控Kv1.2基因(Kcna2)的表達(dá)，其基因啟動(dòng)子區(qū)含有髓樣鋅指蛋白1(MZF1)特異性的結(jié)合基序(_161AGTGGGGA_154)。SNL模型中，MZF1表達(dá)升高，與Kv1.2ASRNA基因啟動(dòng)子特異性基序(_161AGTGGGGA_154)的結(jié)合活性增強(qiáng)，結(jié)合量增多，更為重要的是，MZF1mRNA和Kv1.2ASRNA共同表達(dá)于DRG神經(jīng)元。體外HEK-293T細(xì)胞和DRG細(xì)胞MZF1過(guò)表達(dá)或沉默時(shí)，Kv1

3、.2ASRNA表達(dá)增高或降低，Kv1.2mRNA及蛋白表達(dá)下降或上調(diào)，這和脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)或坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(CCI)模型中MZF1、Kcna2antisenseRNA、Kcna2mRNA表達(dá)情況類似，上述說(shuō)明MZF1可能對(duì)Kcna2antisenseRNA基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，是病理性疼痛的潛在調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。鑒于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，體外實(shí)驗(yàn)畢竟不能完全模擬體內(nèi)過(guò)程，體內(nèi)DRGMZF1與神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系，目前尚不清楚。<

4、br>　　研究目的：
　　本研究通過(guò)大鼠在體DRG顯微注射(Microinjection)，上調(diào)或沉默DRGMZF1基因表達(dá)，觀察大鼠疼痛行為學(xué)變化，檢測(cè)MZF1、Kv1.2ASRNA、Kv1.2mRNA及蛋白表達(dá)變化，研究MZF1對(duì)DRG神經(jīng)元電流和興奮性的影響，確認(rèn)體內(nèi)DRGMZF1-Kv1.2ASRNA-Kv1.2mRNA通路和外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)系，初步探討針對(duì)DRGMZF1基因靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)治療的可行性。<

5、br>　　研究方法：
　　1.雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(MZF1過(guò)表達(dá)組)和對(duì)照組（EGFP組），實(shí)驗(yàn)組DRG注射rAAV5-MZF14×1012GC/μl，對(duì)照組DRG注射rAAV5-EGFP4×1012GC/μl;于DRG注射前1天和DRG注射后1、3、4、6、8周完成后肢左右足機(jī)械性縮足反射閾值(MWT)、熱縮足潛伏期(TWL)和冷縮足潛伏期(CWL)測(cè)定后，取雙側(cè)L4-5DRG，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定大

6、鼠L4-5DRGMZF1mRNA、Kv1.2ASRNA、Kv1.2mRNA表達(dá)，用Western-blot檢測(cè)大鼠L4-5DRGMZF1、Kv1.2蛋白表達(dá)。
　　2.雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（MZF1過(guò)表達(dá)組）和對(duì)照組（EGFP組），實(shí)驗(yàn)組rAAV5-MZF1和AAV5-EGFP混合液2μl（4×1012GC/μl，1∶1混合）DRG注射，對(duì)照組AAV5-EGFP2μl(4×1012，GC/μl)DRG注射，5周后急性分離L4

7、-5DRG神經(jīng)元，全細(xì)胞膜片鉗記錄MZF1過(guò)表達(dá)對(duì)DRG神經(jīng)元興奮性的影響。
　　3.雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組:PBS+CCI組（空白對(duì)照組）:PBS2μlDRG注射7天后，制備大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷模型(CCI);MZF1siRNA+Sham組:MZF1siRNA(10μmol/L)2μ1DRG注射7d后，僅暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎;MZF1siRNA+CCI組:MZF1siRNA(10μmol/L)2μ1DRG注射7d后，制備

8、CCI模型;MZF1scramble+CCI組（錯(cuò)義序列組siRNA）:MZF1scramble(10μmol/L)2μlDRG注射7d后，制備CCI模型;四組大鼠分別于DRG注射前、CCI手術(shù)前
　　CCI術(shù)后3、5、7天分別測(cè)定后肢左右兩足MWT、TWL和CWL。行為學(xué)測(cè)試完成后，取雙側(cè)L4-5DRG，用RT-PCR檢測(cè)大鼠L4-5DRGMZF1mRNA、Kv1.2ASRNA、Kv1.2mRNA表達(dá)，用Western-blot

9、檢測(cè)大鼠L4-5DRGMZF1、Kv1.2蛋白表達(dá)。
　　4.雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組:CCI+PBS組:制備CCI模型7天后，行PBS2μlDRG注射;CCI+EGFP組:制備CCI模型7d后，行AAV5-EGFP(4×1012)2μlDRG注射;CCI+MZF1siRNA組:制備CCI模型7d后，行MZF1siRNA(10μmol/L)2μlDRG注射;CCI+MZF1scramble組:制備CCI模型7d后，行MZF1scr

10、amble(10μmol/L)2μ1DRG注射;四組大鼠分別于CCI制備前1d、術(shù)后7d（DRG注射前），術(shù)后14d，17d分別測(cè)定左右后肢MWT、TWL和CWL。
　　研究結(jié)果：
　　1.單側(cè)L4-5DRG注射rAAV5-MZF1后，同側(cè)大鼠后足機(jī)械性縮足反射閾值(MWT)、熱縮足潛伏期(TWL)和冷縮足潛伏期(CWL)出現(xiàn)時(shí)間依賴性降低，4周后顯著性降低，至少持續(xù)DRG注射后8周，同側(cè)MZFlmRNA和蛋白、Kv1.2A

11、SRNA表達(dá)顯著降低，Kv1.2mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加，對(duì)側(cè)未出現(xiàn)行為學(xué)和上述分子的變化。
　　2.DRGMZF1的過(guò)表達(dá)顯著增加細(xì)胞膜靜息電位，降低動(dòng)作電位發(fā)放的注入電流的閾值，增加大、中型DRG神經(jīng)元的動(dòng)作電位數(shù)。
　　3.CCI增加同側(cè)L4-5DRG神經(jīng)元MZF1mRNA和Kv1.2ASRNA的表達(dá)，減少Kv1.2mRNA和蛋白的表達(dá)，DRG注射MZF1siRNa后，顯著阻斷CCI誘導(dǎo)的同側(cè)L4-5DRG神經(jīng)元M

12、ZF1mRNA和蛋白、Kv1.2ASRNA增高，翻轉(zhuǎn)CCI誘導(dǎo)的同側(cè)L4-5DRG神經(jīng)元Kv1.2mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，減輕CCI術(shù)后3、5、7天(thedevelopment)的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，熱痛覺(jué)過(guò)敏，冷痛覺(jué)過(guò)敏。MZF1siRNADRG注射顯著減少同側(cè)L4-5DRG神經(jīng)元MZF1mRNA和蛋白、Kv1.2ASRNA的表達(dá)，增加同側(cè)L4-5DRG神經(jīng)元Kv1.2mRNA和蛋白的表達(dá)，但MZF1siRNA錯(cuò)義序列DRG注射，并未影