代謝綜合征血小板活化的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、文章內(nèi)容分為兩部分進(jìn)行闡述：
　　論文Ⅰ代謝綜合征對(duì)急性心肌梗死患者住院心血管事件及花費(fèi)的影響
　　目的：
　　(1)研究MS及各代謝異常組分對(duì)AMI患者住院期間心血管事件及住院花費(fèi)的影響;
　　(2)研究年齡對(duì)AMI患者住院期間心血管事件及住院花費(fèi)的影響，并分析年齡及MS的交互作用;
　　(3)探討影響AMI患者及老年AMI患者住院花費(fèi)及心血管事件的因素。
　　方法：
　　選擇AMI患者997

2、例，采集患者住院期間病歷資料，包括患者住院號(hào)、年齡、身高、體重、入院診斷、出院診斷、住院時(shí)間、住院花費(fèi)、吸煙史、既往病史、家族史、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、冠脈造影結(jié)果、心臟彩超結(jié)果、住院期間并發(fā)癥及用藥情況。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)會(huì)(CDS) MS診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組。根據(jù)AMI患者是否合并MS，將其分為2組:不合并MS的AMI患者及合并MS的AMI患者。為了研究MS哪一代謝組份對(duì)AMI影響作用較大，我們根據(jù)AMI患者是否合并超重、高血糖、高血壓及

3、血脂紊亂將其分組。根據(jù)AMI患者是否合并MS及MS代謝組份，將其分為3組:沒有MS代謝組份的AMI患者，含有MS代謝組份但不合并MS的AMI患者（即含有1-2個(gè)MS代謝組份的AMI患者），合并MS的AMI患者。為了研究年齡對(duì)MS的作用是否有交叉影響，我們根據(jù)年齡及是否合并MS將其分組。我們定義年齡≥65歲為老年人群，因此將AMI患者分為4組:年輕的non-MS AMI患者，年輕的MS AMI患者，老年non-MS AMI患者，老年MS

4、AMI患者。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較各組住院期間并發(fā)癥發(fā)生率及住院花費(fèi)，并用回歸的方法篩選影響住院期間并發(fā)癥發(fā)生及住院花費(fèi)的危險(xiǎn)因素，計(jì)算成本效果比值(CER)及增量成本效果比值(ICER)。
　　結(jié)果：
　　(1) AMI患者性別及年齡構(gòu)成情況:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2011-2013年度AMI入院患者男性占70％，女性占30％。發(fā)病年齡主要集中在45-84歲。其中，男性的發(fā)病年齡主要集中于55-64歲，女性則從55歲開始AMI發(fā)病增

5、多，75-84歲發(fā)病人數(shù)最多。隨著年齡的增長，女性患者數(shù)量與男性患者數(shù)量的比值逐漸增加。
　　(2)AMI患者M(jìn)S及代謝異常組分構(gòu)成情況:AMI患者M(jìn)S患病率為39％，BMI指數(shù)超過25的有52％，空腹血糖升高的有53％，高血壓患病率為66％，高TG的有30％，低HDL的有22％。
　　(3)AMI患者基本臨床資料及治療情況的比較:與未合并MS的AMI患者相比，合并MS的AMI患者收縮壓、舒張壓、心率、Cho、TG、LDL、

6、血糖、BUN、Cr、UA、尿蛋白以及高血壓、糖尿病、冠心病家族史均升高（P＜0.05～0.001），而男性比例、年齡、HDL、LDH及CK水平顯著低于無MS的AMI患者(P＜0.05～0.001)。與無MS的AMI患者相比，合并MS的AMI患者支架置入率、二次血運(yùn)重建率、阿司匹林、ACEI及利尿劑的使用無差別(P＞0.05)，ADP受體抑制劑、β受體阻滯劑、ARB、他汀類藥物及鈣離子拮抗劑使用率增加(P＜0.05～0.001)。

7、　　結(jié)論：
　　(1) MS使AMI患者住院期間無事件生存率降低，每日住院花費(fèi)增加，但與含1-2個(gè)MS組分的AMI患者相比無差異;
　　(2)空腹血糖升高、高血壓及HDL使AMI患者住院期間不良心血管事件發(fā)生增多，BMI指數(shù)升高及空腹血糖升高會(huì)顯著增加AMI患者住院花費(fèi);
　　(3)老年AMI患者住院期間不良心血管事件增多，住院時(shí)間延長，住院花費(fèi)增多;
　　(4) PCI是預(yù)測(cè)AMI住院期間急性心衰發(fā)作的獨(dú)立因素

8、，尿蛋白是預(yù)測(cè)AMI住院期間房性及室性心律失常發(fā)生的獨(dú)立因素，阿司匹林是強(qiáng)有力的獨(dú)立保護(hù)因素，顯著減少AMI患者住院期間不良心血管事件的發(fā)生;
　　(5)PCI、二次血運(yùn)重建及多支血管病變是預(yù)測(cè)AMI住院花費(fèi)的主要因素，BMI及PCI是預(yù)測(cè)老年AMI住院花費(fèi)的主要因素;
　　(6)PCI治療對(duì)AMI患者是成本效果較好的，MS及老齡化使PCI成本效果降低。
　　論文ⅡEMP-PDI在代謝綜合征血小板活化中的作用機(jī)制

9、>　　目的：
　　(1)研究MS血漿中PDI酶活性變化;
　　(2)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)IR模型;
　　(3)探討EMP-PDI促進(jìn)血小板活化聚集的機(jī)制。
　　方法：
　　(1)臨床病例的選擇及標(biāo)本采集:根據(jù)2009年IDF/AHA/NHLBI/WHF/IAS統(tǒng)一MS診斷標(biāo)準(zhǔn)的臨時(shí)聯(lián)合聲明選擇臨床MS患者。研究對(duì)象隔夜禁食8～10小時(shí)，靜脈采血并分離血漿及微粒。
　　(2)HUVEC培養(yǎng)

10、及IR模型建立:用低糖DMEM完全培養(yǎng)基（10％FBS+400μl/ml生長因子+雙抗）培養(yǎng)HUVEC。分別用低糖、低糖+高胰島素、高糖、高糖+高胰島素培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選濃度條件。用高糖+高胰島素刺激人臍靜脈內(nèi)皮0、2h、6h、12h、24h，篩選時(shí)間條件。
　　(3)分離正常人血小板:采取健康志愿者肘靜脈血于枸櫞酸納抗凝管中，離心分離血小板，并立即應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。
　　(4)流式細(xì)胞術(shù):在BD管中加入適量待檢測(cè)指標(biāo)相應(yīng)的熒光抗體

11、及待測(cè)樣品，用PBS補(bǔ)齊至100μL，室溫或37℃避光孵育15-30min，用400μL4％多聚甲醛固定后上機(jī)檢測(cè)。
　　(5)酶聯(lián)免疫親和捕獲法(ELISA):將AD-1抗體包被于固相載體上，加入待測(cè)樣品37℃孵育2-3h，洗板，檢測(cè)亮氨酸氨基肽酶或胰島素轉(zhuǎn)氫法檢測(cè)PDI酶活性。
　　(6)胰島素轉(zhuǎn)氫法:在96孔板中，分別加入胰島素，待測(cè)樣品及DTT，輕輕混勻，即刻用酶標(biāo)儀在650nm波長下檢測(cè)吸光值，每隔10min檢測(cè)一

12、次，連續(xù)監(jiān)測(cè)90-120min。
　　結(jié)果：
　　(1)MS及正常人血漿微粒及PDI酶活性檢測(cè)。
　　MS患者血漿中微粒上CD41a（7.32±0.37 vs.3.74±0.08，P＜0.05）及CD31（6.03±0.27 vs.3.84±0.09，P＜0.05）的MFI均顯著高于正常人，提示MS患者血液循環(huán)中血小板及內(nèi)皮來源的微粒增多。
　　胰島素轉(zhuǎn)氫法檢測(cè)血漿中PDI酶活性，并繪制酶活性曲線，MS患者血漿中

13、PDI酶活性曲線明顯比正常人坡度更陡，上升速度較快，每10min OD650nm變化顯著高于正常人(P＜0.05)。
　　離心分離微粒，胰島素轉(zhuǎn)氫法檢測(cè)PDI酶活性，并繪制酶活性曲線，MS患者血漿中微粒上的PDI酶活性曲線明顯比正常人坡度更陡，上升速度較快，每10min OD650nm變化顯著高于正常人(P＜0.05)。這些結(jié)果提示MS患者血漿中及循環(huán)中微粒上PDI酶活性增高。
　　(2)HUVEC IR模型的建立。

14、　　培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮，分別用低糖、低糖+高胰島素、高糖、高糖+高胰島素培養(yǎng)基培養(yǎng)。與低糖組相比，低糖+高胰島素組IRS1、PI3K及p-Akt表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。與低糖組相比，高糖組IRS1、PI3K表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），p-Akt表達(dá)降低(P＜0.05)。與低糖組相比，高糖+高胰島素組IRS1、PI3K及p-Akt表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。因此，我們選擇高糖+高胰島素作為胰島素模型建立的條件。
　　選用

15、高糖+高胰島素刺激人臍靜脈內(nèi)皮0、2h、6h、12h、24h，IRS1的表達(dá)在2h及6h時(shí)無明顯變化，從12h開始顯著降低(P＜0.05)，24h仍然處于較低的表達(dá)水平。IRS1下游的PI3K及p-Akt表達(dá)呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，拐點(diǎn)出現(xiàn)在6h時(shí)。如上結(jié)果顯示，高糖高胰島素刺激HUVEC在12h時(shí)開始出現(xiàn)IR，在24h時(shí)仍然穩(wěn)定。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)，我們選擇高糖高胰島素刺激24h作為HUVEC IR模型建立的條件。
　　(3)IR

16、的HUVEC釋放EMP并攜帶PDI。
　　ELISA檢測(cè)IR及正常HUVEC培養(yǎng)上清中的EMP，結(jié)果顯示IR的HUVEC釋放EMP顯著增多(P＜0.05)，IR HUVEC釋放的EMP比正常增多約3倍。ELISA結(jié)合胰島素轉(zhuǎn)氫法檢測(cè)HUVEC培養(yǎng)上清中EMP上的PDI酶活性，結(jié)果顯示IR HUVEC EMP的PDI酶活性曲線明顯比正常對(duì)照組坡度更陡，上升速度較快，每10min OD650nm變化顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，

17、提示IR EMP上PDI酶活性增高。收集IR HUVEC上清，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微粒。采用0.7-0.9微米標(biāo)準(zhǔn)熒光微球圈出微粒的門，CD31標(biāo)記顯示為內(nèi)皮來源。雙色流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)EMP上攜帶PDI。
　　結(jié)論：
　　(1)MS患者血漿中PDI酶活性增高，微粒上攜帶的PDI酶活性增高;
　　(2)高糖高胰島素刺激人臍靜脈內(nèi)皮在12h時(shí)開始出現(xiàn)IR，在24h時(shí)仍然穩(wěn)定;
　　(3)PDI參與了EMP介導(dǎo)的血小板聚集及