腦內(nèi)注射IL-1Ra對(duì)利血平誘導(dǎo)的大鼠行為性抑郁和海馬神經(jīng)再生的影響.pdf

1、背景與目的:
　　近年來抑郁障礙已成為臨床上最常見的一個(gè)問題。目前對(duì)抑郁癥的神經(jīng)生化研究主要有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說,神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)及神經(jīng)可塑性研究等。根據(jù)神經(jīng)可塑性的研究,有人提出神經(jīng)源性假說,認(rèn)為海馬新生神經(jīng)元的產(chǎn)生減少導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)病機(jī)制?？挂钟羲幹委熀罂砂l(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)再生的增加,抗抑郁藥可以促進(jìn)海馬神經(jīng)再生。大量的臨床前研究證實(shí)應(yīng)激可以抑制海馬神經(jīng)再生。應(yīng)激性生活事件是引起抑郁癥的重要原因。應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生減少可能是引起抑

2、郁癥的一種重要的影響因子。抗抑郁藥治療可以阻斷應(yīng)激引起的海馬神經(jīng)再生的減少。5-HT神經(jīng)遞質(zhì)及5-HT類抗抑郁藥可以增加海馬齒狀回神經(jīng)再生,同時(shí)也可以治療抑郁癥。而且,臨床抗抑郁藥物多數(shù)使用1月左右才能夠起效,這與海馬齒狀回神經(jīng)再生從增殖到分化成熟過程經(jīng)歷的時(shí)間相平衡。這可能成熟海馬神經(jīng)再生可能是抗抑郁藥療效的載體,而因此研究海馬神經(jīng)再生對(duì)于揭示抑郁癥發(fā)病的生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。
　　腦內(nèi)IL-1β是介導(dǎo)抑郁癥的重要物質(zhì)。IL-

3、1β是腦內(nèi)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子,在腦內(nèi)發(fā)揮重要的生理調(diào)節(jié)功能。目前大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子參與抑郁癥的發(fā)病過程。腦內(nèi)IL-1β可引起人和動(dòng)物的“病態(tài)行為”,抗抑郁藥物治療行為性抑郁大鼠,既可減輕抑郁癥的癥狀,又可降低大鼠腦內(nèi)IL-1β的水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn),腦室內(nèi)注射IL-1β可誘導(dǎo)大鼠的行為性抑郁,并且IL-1β受體拮抗劑可部分阻斷利血平誘導(dǎo)的大鼠的行為性抑郁。腦內(nèi)注射IL-1β可降低海馬神經(jīng)再生,I

4、L-1β可能介導(dǎo)了海馬的神經(jīng)再生過程,進(jìn)一步影響到了抑郁癥的發(fā)展。
　　本研究擬在利血平誘導(dǎo)的大鼠行為性抑郁模型中探討腦內(nèi)IL-1β影響神經(jīng)元再生過程在抑郁癥發(fā)病中的作用。探討炎性細(xì)胞因子、神經(jīng)再生與抑郁癥的關(guān)系,分析可能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制,為抑郁癥的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　材料與方法:
　　行為性抑郁動(dòng)物模型與檢測(cè):
　　健康、性成熟清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,體重200～260g,飼養(yǎng)在

5、26℃、12:12小時(shí)光照-黑暗循環(huán)的動(dòng)物房中,自由飲食和飲水。本實(shí)驗(yàn)采用4mg/kg的利血平劑量腹腔注射,對(duì)照組注射相應(yīng)的利血平溶劑,建立利血平行為性抑郁模型,通過強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)檢測(cè)大鼠抑郁樣行為。
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　　腹腔注射利血平對(duì)大鼠海馬神經(jīng)再生影響實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為對(duì)照組(Controlgroup,C)和利血平組(Reserpinegroup,R)。在IL-1Ra對(duì)大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)中,隨機(jī)分為對(duì)照組(Co

6、ntrolgroup,C)和利血平組(Reserpinegroup,R),其中每組的一半大鼠腦內(nèi)注射IL-1Ra或PBS。具體分組為:對(duì)照組(Controlgroup,C),利血平組(Reserpinegroup,R),對(duì)照+L-1Ra組(C+L-1Ra),利血平+IL-1Ra組(R+IL-1Ra)。
　　側(cè)腦室插管與注射:
　　在對(duì)側(cè)腦室插管注射IL-1Ra對(duì)大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究中實(shí)驗(yàn)大鼠先進(jìn)行側(cè)腦室導(dǎo)管

7、安裝實(shí)驗(yàn)。通過單臂大鼠腦立體定位儀,定位大鼠右側(cè)側(cè)腦室(前囟后0.9mm,旁1.5mm,顱骨下深3.8mm),插入大鼠腦室微量注射系統(tǒng)套管。固定放置1周后進(jìn)行藥物注射。其中0.01MPBS和0.25ug/ulIL-1Ra通過微量注射泵經(jīng)側(cè)腦室插管注射,4mg/kg利血平和相應(yīng)劑量的乙酸隨后進(jìn)行腹腔注射。
　　海馬神經(jīng)再生的檢測(cè):
　　在利血平注射40h后各組均開始腹腔注射Brdu,75mg/kg,4次/2h,標(biāo)記海馬神經(jīng)再生

8、過程。藥物注射后均以生理鹽水和4％多聚甲醛灌注后,制作冰凍切片,檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)再生過程包括神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化和新生神經(jīng)元改變等。側(cè)腦室插管大鼠需要制作大鼠側(cè)腦室插管部位切片,檢驗(yàn)插管定位的準(zhǔn)確性。利血平注射后48h的大鼠組織用于檢測(cè)海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖;利血平注射后72h的大鼠組織用于檢測(cè)海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞分化及新生未成熟神經(jīng)元;利血平注射后4周的大鼠組織用于檢測(cè)海馬齒狀回新生成熟神經(jīng)元的存活。
　　數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)

9、計(jì):
　　采用Image-ProPlus6.0(IPP)軟件分析免疫組化圖片。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel2003和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,數(shù)據(jù)間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。以P≤0.05為差異具有顯著性,P≤0.01為差異具有高度顯著性。
　　結(jié)果:
　　第一部分:利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁和海馬神經(jīng)再生改變
　　1、腹腔注射利血平誘導(dǎo)大鼠行為性抑郁
　　利血

10、平組腹腔注射利血平4mg/kg,對(duì)照組腹腔注射2%乙酸溶劑,0、24、48和72小時(shí)進(jìn)行15分鐘游泳試驗(yàn),測(cè)定大鼠的漂浮時(shí)間,作為行為性抑郁的指標(biāo)。結(jié)果表明,對(duì)照組與利血平組大鼠游泳試驗(yàn)24h(7.0±0.5和13.4±0.9),48h(7.2±0.6和12.9±0.7),72h(8.0±0.8和12.6±0.9)漂浮時(shí)間相比差異具有顯著性(ANONA,P<0.01)。與對(duì)照組相比利血平組大鼠在利血平腹腔注射后的24～72小時(shí),大鼠的漂

11、浮時(shí)間顯著延長(zhǎng),作用高峰在24～48小時(shí)。結(jié)果表明,腹腔注射4mg/kg的利血平后24-72小時(shí)的大鼠具有行為性抑郁樣表現(xiàn)。
　　2、利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁大鼠海馬神經(jīng)再生的改變
　　目前發(fā)現(xiàn)終生可以神經(jīng)再生的部位:嗅覺系統(tǒng)的SVZ區(qū)和海馬結(jié)構(gòu)齒狀回SGZ區(qū)。成熟腦海馬齒狀回的SGZ區(qū)存在多功能的前體細(xì)胞。前體細(xì)胞可以增殖、遷移分化、成熟生產(chǎn)新生的神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞等,整個(gè)過程成為神經(jīng)再生。大鼠海馬齒狀回神經(jīng)

12、再生周期約為4周,其中神經(jīng)前體細(xì)胞被Brdu標(biāo)記后增殖持續(xù)12-14h。在增殖后的2h開始逐漸向海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層遷移。增殖后的神經(jīng)前體細(xì)胞在第2-7天內(nèi)進(jìn)行分化,其中分化的新生神經(jīng)元在1月左右成熟,表達(dá)成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物NeuN等。
　　利血平組(Reserpinegroup,R)腹腔注射利血平(4mg/kg),對(duì)照組(Controlgroup,C)注射相應(yīng)劑量的乙酸溶劑。大鼠腹腔注射利血平后40小時(shí),兩組開始腹腔注射Brdu

13、(75mg/kg),每2小時(shí)1次,注射4次。對(duì)應(yīng)海馬神經(jīng)再生的時(shí)間過程,分別在注射利血平48h、72h和4周心臟灌注取腦,分別檢測(cè)腦內(nèi)海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、分化和新生神經(jīng)元改變情況。
　　2.1.利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的改變
　　用Brdu標(biāo)記大鼠海馬神經(jīng)再生過程,同時(shí)通過內(nèi)源性增殖標(biāo)記物Ki67檢測(cè)海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖。觀察腹腔注射利血平對(duì)海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響。Brdu和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞

14、在腦部結(jié)構(gòu)中主要集中在海馬齒狀回SGZ區(qū)。其中單位齒狀回面積的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞在對(duì)照組和利血平組的數(shù)目分別為10.86±1.40、5.18±1.16。單位齒狀回面積的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞在對(duì)照組和利血平組的數(shù)目分別為22.4±9.88、11.38±6.71。與對(duì)照組相比,利血平組單位海馬齒狀回面積的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(t=2.162,P<0.01)和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(t=2.695,P<0.05)明顯減少,差異具有顯著性。結(jié)果顯示,利血平

15、誘導(dǎo)的行為性抑郁大鼠的海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖受到抑制。
　　2.2.利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞分化的改變
　　腹腔注射利血平后48h心臟灌注,組織冰凍切片用Brdu免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦內(nèi)海馬齒狀回SGZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞分化。Brdu陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在海馬齒狀回SGZ區(qū)。兩組大鼠單位海馬齒狀回面積的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)經(jīng)Lg10數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后,進(jìn)行K-S檢驗(yàn)后符合正態(tài)分布。兩組單位海馬齒狀回Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分別為3

16、.70±3,71和0.42±0.73。與對(duì)照組相比,利血平組大鼠海馬齒狀回SGZ區(qū)單位海馬齒狀回面積的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)果表明利血平行為性抑郁大鼠的海馬神經(jīng)前體細(xì)胞分化過程受到抑制。
　　2.3.利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁大鼠海馬新生神經(jīng)元的改變
　　在海馬神經(jīng)再生過程第2-10天,神經(jīng)前體細(xì)胞逐漸向神經(jīng)元分化,開始表達(dá)doublecortin(DCX),可作為新生未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物

17、。在7-10天開始表達(dá)成熟神經(jīng)元具有的NeuN等,1月后70%新生神經(jīng)元表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)記物。
　　2.3.1.利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁大鼠海馬新生未成熟神經(jīng)元的改變
　　利血平腹腔注射后72h心臟灌注兩組大鼠,用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦內(nèi)海馬齒狀回DCX(雙皮質(zhì)激素)的表達(dá),DCX表達(dá)于新生未成熟神經(jīng)元,用于檢測(cè)新生未成熟神經(jīng)元。與對(duì)照組相比,利血平組大鼠海馬齒狀回DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、樹突長(zhǎng)度和樹突數(shù)量差異均無顯著性。結(jié)果表明

18、利血平在72h的短期內(nèi)對(duì)海馬齒狀回新生未成熟神經(jīng)元沒有直接影響。
　　2.3.2.利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁大鼠海馬新生成熟神經(jīng)元存活的改變
　　腹腔注射利血平后4周兩組大鼠,心臟灌注后制作冰凍切片,Brdu免疫組織化學(xué)及Brdu和NeuN免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)海馬齒狀回新生神經(jīng)元的存活。兩組大鼠單位海馬齒狀回面積的Brdu和NeuN雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)經(jīng)Lg10數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后,進(jìn)行K-S檢驗(yàn)后符合正態(tài)分布。對(duì)照組和利血平組Brdu和NeuN雙標(biāo)

19、細(xì)胞數(shù)分別為3.80±2.83和0.82±0.99。與對(duì)照組相比,利血平組大鼠單位海馬齒狀回面積的Brdu和NeuN雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)果表明利血平行為性抑郁大鼠的海馬新生神經(jīng)元的存活受到抑制。
　　第二部分:腦內(nèi)IL-1β對(duì)利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁和海馬再生的影響
　　1、腹腔注射利血平誘導(dǎo)大鼠行為性抑郁
　　利血平組大鼠腦室注射IL-1Ra,對(duì)照組大鼠腦室注射等體積0.01MPBS,

20、同時(shí)腹腔注射利血平(4mg/kg)或相應(yīng)劑量的乙酸溶劑后,分別在注射后的1、24和48h測(cè)定游泳試驗(yàn)。結(jié)果顯示,在利血平注射后的1h和24h,腦室注射IL-1Ra對(duì)利血平引起的漂浮時(shí)間的延長(zhǎng)沒有影響;在利血平注射后48h,R與R+IL-1Ra兩組間的平均漂浮時(shí)間為12.87±0.78和8.68±0.76。腦室注射IL-1Ra可反轉(zhuǎn)利血平引起的漂浮時(shí)間的延長(zhǎng)(ANOVA,P<0.01;組間差異比較用SNK法);單純腦室注射IL-1Ra對(duì)正

21、常大鼠的游泳試驗(yàn)沒有影響。
　　2、腦內(nèi)注射IL-1Ra對(duì)利血平誘導(dǎo)的行為性抑郁大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響
　　免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦內(nèi)海馬齒狀回SGZ區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖。在大鼠海馬結(jié)構(gòu)中,Brdu陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在齒狀回SGZ區(qū)。C、R、C+IL-1Ra和R+IL-1Ra4組大鼠單位海馬齒狀回面積的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為5.07±5.66、3.30±2.31、0.97±0.86、6.06±5.13,經(jīng)平方根數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后

22、,進(jìn)行K-S檢驗(yàn)后符合正態(tài)分布。結(jié)果顯示,正常大鼠腦室注射IL-1Ra對(duì)單位海馬齒狀回面積的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量沒有影響(P>0.05,CvsC+IL-1Ra）。結(jié)果提示，腦室利血平可導(dǎo)致大鼠
　　的海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖受到抑制，而腦內(nèi)注射 IL-1Ra 可以逆轉(zhuǎn)利血平誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)前
　　體增殖的抑制。
　　結(jié)論:
　　腹腔注射利血平可以誘導(dǎo)大鼠行為性抑郁，同時(shí)海馬神經(jīng)再生過程受到抑制，而IL-1受體拮抗劑可以