活血化瘀中藥有效成分抗風(fēng)濕作用的晝夜節(jié)律研究.pdf

1、目的:
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種病因不明的自身免疫性疾病，呈慢性、漸進(jìn)性，主要累及滑膜組織，亦可侵襲肺、分泌腺、心血管等關(guān)節(jié)外臟器組織，導(dǎo)致病人的生活質(zhì)量下降。研究發(fā)現(xiàn):腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-1、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子和其它多種因子形成的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參與了RA疾病過程的慢性化，并可能成為疾病治療的新靶點(diǎn)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者從對RA臨床表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制及臨床治療的時(shí)間生物學(xué)角度進(jìn)

2、行了大量研究，證實(shí)了時(shí)間生物療法對RA具有較好的臨床療效。本課題擬通過:①建立小鼠疼痛模型，來探討痛閾的晝夜節(jié)律性，采用正交設(shè)計(jì)方案，分別于痛閾峰值、谷值灌胃給藥觀察中藥有效成分的鎮(zhèn)痛作用;②用1％角叉菜膠致炎小鼠，建立急性關(guān)節(jié)炎模型，篩選其致炎達(dá)峰時(shí)間及足爪容積的晝夜節(jié)律性;③建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-inducedarthritis，AA)模型，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血漿中腫瘤壞死因子-α(tumorne

3、crosisfactor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor,MIF)和褪黑素(melatonin，MET)的晝夜節(jié)律性，并測定其含量，同時(shí)觀察中藥有效成分配伍對實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎炎癥評分的影響，為臨床治療RA合理選擇用藥時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1小鼠痛閾晝夜節(jié)律性的研究

4、　　 1.1熱板法
　　 選擇體重18-22g昆明小鼠60只，均為雌鼠，室溫21-25度。放于恒溫(55±0.5度)水浴熱板上，分別于8、12、16、20、24、4時(shí)共六個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量小鼠出現(xiàn)舔后足所需的時(shí)間，作為該鼠的痛閾值。
　　 1.2輻射熱刺激法（甩尾法）
　　 選擇體重18-22g昆明小鼠40只，雌雄各半，室溫21-25度。將小鼠裝入籠中，鼠尾置于鼠尾光照測痛儀上，光束直射于鼠尾1/3處（距尾尖約1-2

5、cm，用筆涂黑點(diǎn)作標(biāo)記，以便每次光照點(diǎn)在同一位置），分別于8、12、16、20、24、4時(shí)共六個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量小鼠甩尾所需的時(shí)間，作為該鼠的痛閾值。
　　 2采用正交設(shè)計(jì)于痛閾峰、谷值給藥
　　 選擇體重18-22g昆明小鼠80只，均為雌鼠，采用正交設(shè)計(jì)方案（4因素2水平）將中藥（三七總皂苷A+丹參酮ⅡaB+燈盞花素C+川芎嗪D注:ABCD四個(gè)因素100mg/kg、50mg/kg2個(gè)水平）分為8組，另設(shè)對照組:布洛芬組和嗎啡

6、組，每組4只。采用熱板法測量給藥前痛閾值，分別于下午16時(shí)、凌晨4時(shí)給藥，測量給藥后1、2、3小時(shí)小鼠的痛閾值變化。
　　 31％角叉菜膠急性關(guān)節(jié)炎模型的建立
　　 3.11％角叉菜膠致炎高峰時(shí)間篩選
　　 選擇體重18-22g昆明小鼠30只，雌雄各半。測量右后足爪容積后，于右后足跖底部常規(guī)消毒，皮內(nèi)注射1％角叉菜膠(30ul/只)建立急性關(guān)節(jié)炎模型。分別測量1.5、2.5、3.5、4.5小時(shí)足爪容積，觀察角叉菜

7、膠致炎高峰時(shí)間。
　　 3.21％角叉菜膠致炎小鼠右后足爪容積晝夜節(jié)律性研究
　　 選擇體重18-22g昆明小鼠40只，均為雌鼠。隨機(jī)分為上午8時(shí)、下午14時(shí)、晚20時(shí)、凌晨2時(shí)共4組，每組10只。分別于凌晨4點(diǎn)半、上午10點(diǎn)半、下午16點(diǎn)半、晚22點(diǎn)半將實(shí)驗(yàn)小鼠右后足跖底部常規(guī)消毒，皮內(nèi)注射1％角叉菜膠(30ul/只)建立急性關(guān)節(jié)炎模型，分別于3.5小時(shí)后（角叉菜膠致炎達(dá)峰時(shí)間）測量右后足爪容積，觀察小鼠足爪容積的晝夜

8、節(jié)律性。
　　 4AA模型的建立及炎性細(xì)胞因子的晝夜節(jié)律性
　　 選擇體重150-180g的Wistar大鼠，雌雄各半。測量體重及雙側(cè)足爪容積后，于右后足跖底部常規(guī)消毒，皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(0.2mL/只)建立AA大鼠模型。其中4只大鼠用相同方法注入等量生理鹽水。造模后第19天將出現(xiàn)二次反應(yīng)且關(guān)節(jié)炎指數(shù)(ArthritisIndex，AI)大于5的大鼠隨機(jī)取出10只（雌雄各半）分別于8、12、16、20、24、4共六個(gè)

9、時(shí)間點(diǎn)于尾靜脈采血、分離血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血漿中TNF-α、IL-1β、MIF、MLT的晝夜節(jié)律性。其余成模大鼠隨機(jī)分為模型組、來氟米特(LEF)上午9點(diǎn)組、來氟米特(LEF)晚21點(diǎn)組、雷公藤多苷(TG)上午9點(diǎn)組、雷公藤多苷(TG)晚21點(diǎn)組、中藥聯(lián)合（三七總皂苷+丹參酮Ⅱa+燈盞花素+川芎嗪）上午9點(diǎn)組、中藥聯(lián)合（三七總皂苷+丹參酮Ⅱa+燈盞花素+川芎嗪）晚21點(diǎn)組，每組4只，注射生理鹽水大鼠為空白對照組。

10、當(dāng)日測量大鼠體重，用足趾容積測量儀測量各組大鼠足爪容積。各治療組連續(xù)灌胃給藥18天（空白組和模型組灌胃給予等量生理鹽水），于給藥結(jié)束后第2天測量各組大鼠體重、足爪容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)。然后10％水合氯醛麻醉，股動(dòng)脈采血、抗凝，留取血漿，采用ELISA法檢測血漿中TNF-α、IL-1β、MIF、MLT含量。
　　 所有數(shù)據(jù)均采用SPSSforwindows13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s）表

11、示，各組間兩兩比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)或非參數(shù)檢驗(yàn)(Nonparametrictest)，正交設(shè)計(jì)(theorthogonaldesign)采用正交設(shè)計(jì)資料的方差分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1小鼠痛閾晝夜節(jié)律性（見Table1）
　　 1.1熱板法
　　 小鼠痛閾(s)分別為:上午8時(shí)19.19±4.40、中午12時(shí)20.09±7.18、下午16時(shí)2

12、2.59±6.47、晚20時(shí)20.74±7.69、晚24時(shí)19.92±6.67、凌晨4時(shí)17.97±6.29;下午16時(shí)小鼠痛閾值明顯高于其它組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);凌晨4時(shí)痛閾值明顯低于其它組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。
　　 1.2輻射熱刺激法
　　 小鼠痛閾(s)分別為:上午8時(shí)3.86±1.18、中午12時(shí)4.17±1.22、下午16時(shí)4.80±1.10、晚20時(shí)4.05±1.25、晚24時(shí)3.67

13、±1.17、凌晨4時(shí)4.18±0.95;下午16時(shí)小鼠痛閾值明顯高于其它組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;晚24時(shí)痛閾值明顯低于其它組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。
　　 2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察中藥有效成分的鎮(zhèn)痛作用(見Table2-5)
　　 下午16時(shí)各組小鼠痛閾值(s)分別為:給藥前23.47±6.14、中藥給藥后1小時(shí)20.29±7.67、中藥給藥后2小時(shí)21.51±7.36、中藥給藥后3小時(shí)22.86±11.00

14、;布洛芬給藥后1小時(shí)29.61±2.03、布洛芬給藥后2小時(shí)36.95±15.03、布洛芬給藥后3小時(shí)35.69±10.38;嗎啡給藥后1小時(shí)45.13±4.92、嗎啡給藥后2小時(shí)53.18±1.54、嗎啡給藥后3小時(shí)54.66±4.59;中藥組給藥前及給藥后1、2、3小時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）;布洛芬組給藥后2、3小時(shí)痛閾值高于給藥前及給藥后1小時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;嗎啡組給藥后2、3小時(shí)痛閾值高于給藥前及給藥后1小

15、時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;中藥有效成分單獨(dú)作用時(shí)無明顯鎮(zhèn)痛效果（P＞0.05）;各中藥有效成分之間無交互作用(P＞0.05）;布洛芬組、嗎啡組痛閾值明顯高于中藥組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;嗎啡組痛閾值明顯高于布洛芬組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。
　　 凌晨4時(shí)各組小鼠痛閾值(s)分別為:給藥前18.41±6.75、中藥給藥后1小時(shí)20.15±7.60、中藥給藥后2小時(shí)24.10±12.29、中藥給藥后3小時(shí)27

16、.73±11.29;布洛芬給藥后1小時(shí)30.57±1.29、布洛芬給藥后2小時(shí)32.04±1.95、布洛芬給藥后3小時(shí)29.09±3.87;嗎啡給藥后1小時(shí)50.54±7.08、嗎啡給藥后2小時(shí)54.11±3.55、嗎啡給藥后3小時(shí)53.97±4.86;中藥組給藥后2、3小時(shí)痛閾值明顯高于給藥前，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;給藥后1小時(shí)痛閾值高于給藥前，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）;給藥后3小時(shí)痛閾值顯著高于給藥前、給藥后1、2小時(shí)

17、，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;布洛芬組給藥后2小時(shí)痛閾值高于給藥前及給藥后1、3小時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;嗎啡組給藥后2、3小時(shí)痛閾值高于給藥前及給藥后1小時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;中藥有效成分單獨(dú)作用時(shí)無明顯鎮(zhèn)痛效果(P＞0.05);各中藥有效成分之間無交互作用(P＞0.05）;布洛芬組、嗎啡組痛閾值明顯高于中藥組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;嗎啡組痛閾值明顯高于布洛芬組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。
　

18、　 31％角叉菜膠致炎高峰時(shí)間（見Table6）
　　 各組小鼠右后足爪容積(mL)分別為:給藥前0.24±0.03、給藥后1.5小時(shí)0.27±0.04、給藥后2.5小時(shí)0.29±0.04、給藥后3.5小時(shí)0.31±0.03、給藥后4.5小時(shí)0.29±0.03，給藥前小鼠右后足爪容積明顯低于給藥后1.5、2.5、3.5、4.5小時(shí)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;給藥后3.5小時(shí)小鼠右后足爪容積明顯高于給藥前、給藥后1.5、2

19、.5、4.5小時(shí)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 41％角叉菜膠致炎小鼠右后足爪容積晝夜節(jié)律性（見Table7）
　　 各組小鼠足爪容積值(mL)分別為:上午8時(shí)0.32±0.03、下午14時(shí)0.32±0.02、晚20時(shí)0.32±0.02、凌晨2時(shí)0.32±0.03;1％角叉菜膠致炎后各組小鼠足爪容積無明顯晝夜節(jié)律性(P＞0.05)。
　　 5晝夜節(jié)律給藥對AA大鼠一般情況的影響（見Table8）

20、　　 與模型組相比，LEF、TG、中藥聯(lián)合組一般情況均有所改善。
　　 造模前大鼠體重(g)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 造模后第19天，各組大鼠體重（g)分別為:空白組276.00±34.82、模型組269.33±13.97、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組265.00±20.85、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組215.50±21.17、TG9點(diǎn)組249.50±18.41、TG21點(diǎn)組211.75±5.06、LEF9點(diǎn)組230.67±1

21、5.81、LEF21點(diǎn)組240.25±25.01;模型組、LEF組、TG組、中藥聯(lián)合組大鼠體重明顯低于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);但模型組、LEF組、TG組、中藥聯(lián)合組組間體重比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。
　　 給藥18天后，各組大鼠體重(g)分別為:空白組301.00±22.86、模型組212.50±5.00、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組219.75±15.17、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組217.75±14.37、TG9點(diǎn)組2

22、55.33±32.41、TG21點(diǎn)組268.75±18.87、LEF9點(diǎn)組230.67±15.81、LEF21點(diǎn)組240.25±25.01;模型組、LEF組、TG組、中藥聯(lián)合組的大鼠體重低于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);中藥聯(lián)合9、21點(diǎn)組、LEF9點(diǎn)組、TG21點(diǎn)組體重高于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);LEF21點(diǎn)組、TG9點(diǎn)組體重高于模型組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;給藥時(shí)間比較:TG9點(diǎn)組體重低于21點(diǎn)組

23、，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);中藥聯(lián)合9點(diǎn)與21點(diǎn)組、LEF9點(diǎn)與21點(diǎn)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。
　　 6晝夜節(jié)律給藥對AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（見Table9）
　　 隨著造模時(shí)間的延長，除空白對照組外，各組大鼠關(guān)節(jié)紅腫程度逐漸加重，關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸升高。
　　 造模19天各組大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)分別為:模型組11.00±1.00、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組9.5±1.00、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組9.75±1.50、TG9點(diǎn)組

24、11.50±2.89、TG21點(diǎn)組10.25±2.50、LEF9點(diǎn)組9.00±1.00、LEF21點(diǎn)組10.50±1.00;各組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 灌胃18天后，各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)分別為:模型組12.25±1.26、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組7.75±0.50、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組7.50±0.58、TG9點(diǎn)組8.50±1.73、TG21點(diǎn)組7.25±1.89、LEF9點(diǎn)組6.25±0.50、LEF21點(diǎn)組6.75±0.

25、50;中藥聯(lián)合組、TG組、LEF組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);LEF組關(guān)節(jié)炎指數(shù)低于TG組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);LEF組關(guān)節(jié)炎指數(shù)低于中藥聯(lián)合組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;給藥時(shí)間比較:中藥聯(lián)合9點(diǎn)與21點(diǎn)組、TG9點(diǎn)與21點(diǎn)組、LEF9點(diǎn)與21點(diǎn)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。
　　 7晝夜節(jié)律給藥對AA大鼠足爪腫脹抑制率的影響(見Table10)
　　 灌胃18天后造模側(cè)（

26、右足）抑制率(％)分別為:模型組-0.616±0.130、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組0.221±0.235、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組0.032±0.237、TG9點(diǎn)組0.131±0.235、TG21點(diǎn)組0.118±0.115、LEF9點(diǎn)組0.328±0.224、LEF21點(diǎn)組0.439±0.124，中藥聯(lián)合組、TG組、LEF組抑制率高于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);模型組足爪容積持續(xù)增長，無抑制表現(xiàn)，LEF21點(diǎn)組抑制率明顯高于LEF9點(diǎn)組、中藥聯(lián)

27、合9、21點(diǎn)組、TG9、21點(diǎn)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;給藥時(shí)間比較:中藥聯(lián)合9點(diǎn)與21點(diǎn)組、TG9點(diǎn)與21點(diǎn)組、LEF9點(diǎn)與21點(diǎn)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 灌胃18天后非造模側(cè)（左足）抑制率(％)分別為:模型組-1.373±2.012、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組-0.189±1.815、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組1.255±2.336、TG9點(diǎn)組0.410±0.990、TG21點(diǎn)組1.585±2.764、LEF9點(diǎn)組0.33

28、5±0.470、LEF21點(diǎn)組0.641±0.608，中藥聯(lián)合組、TG組、LEF組抑制率高于模型組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）;模型組足爪容積持續(xù)增長，無抑制表現(xiàn)。給藥時(shí)間比較:中藥聯(lián)合9點(diǎn)與21點(diǎn)組、TG9點(diǎn)與21點(diǎn)組、LEF9點(diǎn)與21點(diǎn)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 8AA大鼠血漿中TNF-α、IL-1β、MIF、MLT的晝夜節(jié)律性(見Table11)
　　 8.1TNF-α的晝夜節(jié)律性(見Fig.13

29、)
　　 凌晨4時(shí)0.099±0.043、上午8時(shí)0.095±0.199、中午12時(shí)0.088±0.105、下午16時(shí)0.085±0.008、晚20時(shí)0.098±0.019、晚24時(shí)0.106±0.009，峰值為晚24-凌晨4時(shí)之間，谷值為下午16時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。
　　 8.2IL-1β的晝夜節(jié)律性(見Fig.14)
　　 凌晨4時(shí)0.737±0.038、上午8時(shí)0.691±0.102、中午12

30、時(shí)0.562±0.062、下午16時(shí)0.588±0.058、晚20時(shí)0.730±0.094、晚24時(shí)0.643±0.025，峰值為凌晨4時(shí)，谷值為中午12時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　 8.3MIF的晝夜節(jié)律性(見Fig.15)
　　 凌晨4時(shí)0.457±0.117、上午8時(shí)0.510±0.216、中午12時(shí)0.453±0.058、下午16時(shí)0.392±0.071、晚20時(shí)0.728±0.273、晚24時(shí)0.5

31、79±0.176，峰值為晚20時(shí)，谷值為下午16時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）。
　　 8.4MLT的晝夜節(jié)律性(見Fig.16)
　　 凌晨4時(shí)0.119±0.012、上午8時(shí)0.115±0.024、中午12時(shí)0.105±0.021、下午16時(shí)0.087±0.007、晚20時(shí)0.093±0.010、晚24時(shí)0.136±0.036，峰值為晚24-凌晨4時(shí)之間，谷值為下午16時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　

32、 9晝夜節(jié)律給藥治療后AA大鼠血漿TNF-α、IL-1β、MIF、MLT的變化(見Table12，13)
　　 9.1血漿TNF-α(ng/mL)含量比較(見Fig.12)
　　 各組大鼠血漿TNF-α含量(ng/mL)分別為:空白組0.080±0.004、模型組0.187±0.005、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組0.138±0.028、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組0.130±0.197、TG9點(diǎn)組0.144±0.018、TG21點(diǎn)組0.153

33、±0.030、LEF9點(diǎn)組0.136±0.030、LEF21點(diǎn)組0.154±0.008;模型組、中藥聯(lián)合組、TG組、LEF組血漿TNF-α水平明顯高于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;中藥聯(lián)合組、TG組、LEF組明顯低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05）;中藥聯(lián)合組、TG組、LEF組之間TNF-α水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）;給藥時(shí)間比較:中藥聯(lián)合9點(diǎn)與21點(diǎn)組、TG9點(diǎn)與21點(diǎn)組、LEF9點(diǎn)與21點(diǎn)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞

34、0.05)。
　　 9.2血漿IL-1β(ng/mL)含量比較(見Fig.12)
　　 各組大鼠血漿IL-1β含量(ng/mL)分別為:空白組0.697±0.082、模型組0.715±0.053、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組0.727±0.065、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組0.633±0.045、TG9點(diǎn)組0.601±0.065、TG21點(diǎn)組0.592±0.109、LEF9點(diǎn)組0.599±0.104、LEF21點(diǎn)組0.472±0.032;LEF

35、組血漿IL-1β水平明顯低于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);中藥聯(lián)合組、TG組低于空白對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);LEF組、TG組明顯低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;中藥聯(lián)合組低于模型組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;給藥時(shí)間比較:LEF21點(diǎn)組IL-1β水平明顯低于LEF9點(diǎn)組、中藥聯(lián)合9、21點(diǎn)組、TG9、21點(diǎn)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;中藥聯(lián)合21點(diǎn)組低于9點(diǎn)組，TG21點(diǎn)組低于TG9點(diǎn)組

36、，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 9.3血漿MIF(ng/mL)含量比較(見Fig.12)
　　 各組大鼠血漿MIF含量(ng/mL)分別為:空白組1.028±0.014、模型組1.265±0.007、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組1.181±0.047、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組1.168±0.038、TG9點(diǎn)組1.142±0.406、TG21點(diǎn)組1.181±0.044、LEF9點(diǎn)組1.071±0.009、LEF21點(diǎn)組1.082±0.

37、006;模型組、中藥聯(lián)合組、TG組血漿MIF水平明顯高于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);LEF組高于空白對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;中藥聯(lián)合組、TG組、LEF組明顯低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);LEF組MIF水平明顯低于中藥聯(lián)合組、TG組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);中藥聯(lián)合組、TG組間無差異性(P＞0.05);給藥時(shí)間比較:中藥聯(lián)合9點(diǎn)與21點(diǎn)組、TG9點(diǎn)與21點(diǎn)組、LEF9點(diǎn)與21點(diǎn)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

38、異(P＞0.05)。
　　 9.4血漿MLT(ng/mL)含量比較(見Fig.12)
　　 各組大鼠血漿MLT含量(ng/mL)分別為:空白組0.089±0.002、模型組0.159±0.002、中藥聯(lián)合9點(diǎn)組0.127±0.013、中藥聯(lián)合21點(diǎn)組0.145±0.013、TG9點(diǎn)組0.141±0.013、TG21點(diǎn)組0.136±0.015、LEF9點(diǎn)組0.101±0.004、LEF21點(diǎn)組0.103±0.008;模型組

39、、中藥聯(lián)合組、TG組血漿MLT水平明顯高于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，LEF組高于空白對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）;中藥聯(lián)合組、TG組、LEF組明顯低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;中藥聯(lián)合組、TG組高于LEF組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）;給藥時(shí)間比較:中藥聯(lián)合9點(diǎn)組低于中藥聯(lián)合21點(diǎn)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);TG9點(diǎn)與21點(diǎn)組、LEF9點(diǎn)與21點(diǎn)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　

40、 結(jié)論:
　　 1小鼠的痛閾具有峰值在下午、谷值在凌晨的晝夜節(jié)律;佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血TNF-α、IL-1β、MIF、MLT水平呈現(xiàn)峰值位于凌晨、谷值位于下午的晝夜節(jié)律;角叉菜膠所致急性關(guān)節(jié)炎小鼠的足爪腫脹度未顯示晝夜變化。
　　 2活血化瘀中藥有效成分三七總皂苷、丹參酮Ⅱa、燈盞花素、川芎嗪配伍能顯著提高小鼠痛閾，凌晨4:00時(shí)給藥優(yōu)于下午16:00時(shí)給藥。
　　 3來氟米特、雷公藤多苷及活血化瘀中藥有效成分