醋酸棉酚陰道給藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMs)是一種婦科常見病,在育齡婦女中發(fā)病率高達(dá)10％-20%,且呈逐年上升趨勢。病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確。雖然是良性疾病,卻具有增生、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等惡性行為;雖可以侵犯全身任何部位,但以卵巢和宮骶韌帶最為常見。EMs常引起盆腔疼痛、痛經(jīng)及不孕等癥狀,嚴(yán)重影響婦女生活質(zhì)量。EMs目前按其組織發(fā)生學(xué)、臨床表現(xiàn)以及處理的不同分為腹膜型、卵巢型及深部浸潤型3種類型。但無論那一種類型的盆腔EM

2、s患者常同時(shí)合并不同程度的深部浸潤型子宮內(nèi)膜異位癥(Deep Infiltrating Endometriosis,DIE)。DIE是Ebts的一種特殊類型,該型病灶主要分布于子宮直腸陷凹(Douglas窩)、子宮骶骨韌帶、直腸陰道隔等部位,是引起EMs疼痛(包括痛經(jīng)、性交痛、經(jīng)期排便疼痛和非周期性慢性盆腔疼痛)主要癥狀的基本根源。目前EMs的治療仍然是個(gè)棘手的問題。EMs現(xiàn)有的治療包括手術(shù)和/或藥物治療。手術(shù)治療雖可切除病灶并改善患者

3、的疼痛癥狀,以及提高患者術(shù)后妊娠率,但手術(shù)本身風(fēng)險(xiǎn)大又具有創(chuàng)傷性,且術(shù)后復(fù)發(fā)率高。藥物治療,包括GnRH-α、達(dá)那唑、口服避孕藥、孕酮等,雖可暫時(shí)縮小病灶,改善患者的臨床癥狀,但全身毒副反應(yīng)大并且價(jià)格昂貴而又不能治愈,限制其長期應(yīng)用。因此,探索開發(fā)有效的新藥物用以治療EMs是目前EMs臨床研究的熱點(diǎn)。近年臨床研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用藥物釋放系統(tǒng)局部給藥,如芳香酶抑制劑陰道栓、達(dá)那唑陰道環(huán)、左炔諾孕酮官內(nèi)緩釋系統(tǒng)(曼月樂)等能穩(wěn)定獲得局部藥物有效治

4、療濃度達(dá)到臨床期望治療療效,而全身血液濃度很低以致于幾乎不引起藥物毒副反應(yīng),從而獲得臨床長期治療的目的。因此,設(shè)想應(yīng)用療效肯定的藥物通過改變藥物給藥途徑,局部給藥使局部達(dá)到藥物有效治療濃度以期長期治療是臨床藥物治療EMs患者的一種新思路。棉酚是從錦葵科植物棉籽中分離得到的一種黃色多酚類化合物,以醋酸棉酚的形式被廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域。醋酸棉酚口服多年來被成功用于男性避孕,并有抗腫瘤、抗病毒等活性。近年研究表明,醋酸棉酚口服給藥可有效用以治療E

5、Ms和子宮肌瘤等雌激素依賴性疾病,尤其對(duì)EMs治療療效幾乎可達(dá)100%。但遺憾的是該藥的嚴(yán)重低鉀血癥毒副反應(yīng)長期阻礙該藥在臨床上推廣使用?；诖姿崦薹又委烢Ms的療效,以及局部應(yīng)用藥物釋放系統(tǒng)的臨床報(bào)道。本研究構(gòu)建EMs大鼠動(dòng)物模型,設(shè)計(jì)陰道棒攜帶醋酸棉酚給藥釋放系統(tǒng)用以治療大鼠EMs。旨在探索醋酸棉酚陰道棒的體外釋放規(guī)律、動(dòng)物體內(nèi)動(dòng)態(tài)釋放情況,觀察醋酸棉酚陰道棒治療EMs的療效,并探討其作用機(jī)理。
　　材料和方法：選用SD雌性未

6、孕大鼠,體重為(230±20)克,鼠齡8-12周,購自浙江中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心(n=56),于動(dòng)情期或非動(dòng)情期通過自體子宮內(nèi)膜層及肌層縫合于Douglas窩,分組建立EMs自體移植動(dòng)物模型,造模2周/3周/4周后開腹觀察Douglas窩粘連情況、異位囊腫顏色、表面血管分布、囊液性狀,并測定囊腫體積V(A×B×C,A、B、C分別為囊腫的長、寬、高)。比較動(dòng)情期及非動(dòng)情期成模率的差異。選擇動(dòng)情期,將SD大鼠自體子宮內(nèi)膜縫合于Douglas窩建立

7、EMs大鼠模型,模型復(fù)制后3周,第二次開腹,測定囊腫體積;將模型成功組(n=21)隨機(jī)分為(1)實(shí)驗(yàn)組:醋酸棉酚陰道棒給藥組(n=10)及(2)對(duì)照組:單純硅膠陰道棒給藥組(n=11),按轉(zhuǎn)換因子折算,大鼠4.08mg/kg的劑量近似于臨床上50kg成人0.19mg/d的用量,每組于給藥7d后擇動(dòng)情期觀測藥物療效。觀察粘連情況,測定囊腫體積,取囊腫及在位內(nèi)膜,置中性福爾馬林固定過夜,常規(guī)石蠟包埋、4um切片,HE染色鏡下觀(間質(zhì)、腺體、

8、囊腔),CK及Vim免疫組化染色分別鑒定腺上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞,bcl-2、bax免疫組化染色,并image-proplus6.0專業(yè)圖像分析軟件分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組bcl-2、bax的表達(dá)有無差異。醋酸棉酚陰道棒以硅凝膠混合物為載體材料,其制備為:取硅凝膠(以下簡稱A)與硅凝膠硫化劑(以下簡稱B),按照0.9:1.0(w:w)混合均勻;另稱取醋酸棉酚適量,按照藥物與載體材料的質(zhì)量百分比為10%,加入混合均勻的硅凝膠乳液,攪拌、混勻得載藥的

9、硅凝膠乳液。將藥物的硅凝膠乳液注入中空聚氯乙烯塑料管中,在80℃條件下硫化2小時(shí),剪開塑料管,得到醋酸棉酚陰道棒,按照劑量切割成適當(dāng)?shù)拇笮　闇y定醋酸棉酚體外釋放狀況,取醋酸棉酚陰道給藥棒(含藥1mg),放入100ml的釋放介質(zhì)(0.5%Tween-80)中,37℃恒溫振蕩,60次/分鐘,于0、4、12、24、48、96h、6d、8、10、12、14、16、20、24、30、35、40、45、50d取出全部釋放介質(zhì),并補(bǔ)充等溫釋放介質(zhì)5

10、0ml。取樣1ml樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,取濾液20μL注入高效液相色譜儀,測定藥物含量,按照公式(1)計(jì)算藥物的累積釋放量。研究藥物體外釋放情況。F(t)=(A樣/A標(biāo))×C標(biāo)×V/1000×100%(1)式中:A樣為樣品的峰面積;A標(biāo)為對(duì)照品的峰面積;C標(biāo)為對(duì)照品濃度(μg/mL);V為釋放介質(zhì)的體積。樣品的高效液相色譜條件為:流動(dòng)相:甲醇:水(90:10);色譜柱:DikmaC18-ODS(250 mm×4.6 mm,5μ

11、m);流速:1 ml·min-1;檢測波長:238nm;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20μL。為測定醋酸棉酚體內(nèi)動(dòng)態(tài)釋放狀況,醋酸棉酚陰道棒按4.08mg/kg的劑量在模型動(dòng)物(n=18)中給藥,分別于給藥后0,1,2,3,4,5,10,11,12d取血,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采3份血樣,肝素鈉抗凝,離心,分離血漿,置冰箱-20℃冷凍保存。次日進(jìn)行高效液相色譜儀分離測定藥物血漿濃度。樣品的高效液相色譜條件為:流動(dòng)相:0.2%HAC:乙腈=25:75;色譜

12、柱:Agilent Eclipse-XDB(150×4.6mm,5μm);流速:1.2 ml·min-1;檢測波長:235nm;柱溫:25℃。
　　結(jié)果:1.以SD大鼠為模型動(dòng)物,采用自體子宮內(nèi)膜及肌層聯(lián)合縫合于Douglas窩進(jìn)行EMs模型構(gòu)建,于建模第3周開腹觀察移植內(nèi)膜生長情況,選擇囊腫最大徑在2mm以上的囊腫為模型成功者?？偝赡Ｂ蕿?2.35%(42/51);動(dòng)情期建模的成模率為82.93%(34/41);非動(dòng)情期建模的成

13、模率為80.0%(8/10)。且動(dòng)物模型建模3周組(0.3759cm3)與4周組異位囊腫體積(0.3843cm3)無明顯改變。2.醋酸棉酚陰道棒制備中醋酸棉酚與載體材料的比例為1:9時(shí),體外實(shí)驗(yàn)控制釋放效果較好,陰道棒中藥物的體外釋放呈現(xiàn)明顯的雙相釋放特點(diǎn),在24小時(shí)內(nèi)藥物的釋放較快,釋放總藥物量的25%;隨后藥物的釋放速率減緩,15天以后藥物呈現(xiàn)恒速釋放的特征,每天釋放藥物量為0.3%,能穩(wěn)定釋放6個(gè)月以上。3.醋酸棉酚陰道棒以4.0

14、8mg/kg的劑量在模型動(dòng)物中給藥,采血后予高效液相色譜儀分離測定藥物血漿濃度。體內(nèi)血藥濃度在24h達(dá)到高峰,隨后基本保持一極低的血藥濃度呈現(xiàn)恒速釋放的特征。4.實(shí)驗(yàn)組醋酸棉酚陰道棒給藥7d后體積抑制率高于對(duì)照組處理后,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.247)。實(shí)驗(yàn)組給藥7d后與對(duì)照組處理后腹腔粘連無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.790)。5.醋酸棉酚陰道棒給藥7 d后,相比對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組異位囊腫及在位子宮內(nèi)膜均表現(xiàn)為凋亡增加。實(shí)驗(yàn)組異位囊腫bcl-

15、2表達(dá)減少(p=0.012),bax表達(dá)增加(p=0.004),實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜亦較對(duì)照組子宮內(nèi)膜中bcl-2表達(dá)減少(p=0.015),bax表達(dá)增加(p=0.007),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組異位內(nèi)膜bcl-2,bax表達(dá)量與子宮內(nèi)膜無差異(p=0.227/0.873)。
　　結(jié)論:1.SD大鼠自體子宮內(nèi)膜及肌層聯(lián)合縫合建立EMs動(dòng)物模型,動(dòng)情期建模組與非動(dòng)情期建模組成模率無明顯差異。且模型動(dòng)物在建模3周后即成模。2.醋酸棉酚

16、陰道棒中藥物的體外釋放呈現(xiàn)明顯的雙相釋放特點(diǎn),24h內(nèi)快速釋放部分能夠迅速在給藥局部達(dá)到足夠的藥物濃度并產(chǎn)生治療作用,后續(xù)的緩釋可維持藥物濃度產(chǎn)生長期的治療作用。3.醋酸棉酚陰道棒的體內(nèi)動(dòng)態(tài)釋放中,24h內(nèi)血藥濃度上升迅速,然后長時(shí)間維持在一低濃度水平。4.實(shí)驗(yàn)組給藥7d后體積抑制率高于對(duì)照組處理后,提示醋酸棉酚陰道棒給藥7d后抑制模型動(dòng)物中異位囊腫的生長,抑制病灶體積,但此差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)擴(kuò)大樣本例數(shù)以進(jìn)一步研究。但醋酸棉酚陰道棒