Rho-kinase在心肌缺血-再灌注損傷和缺血預(yù)適應(yīng)中對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 心肌長時(shí)間缺血可以導(dǎo)致組織損傷以及細(xì)胞死亡,冠狀動(dòng)脈再通是緩解缺血損傷的關(guān)鍵,但較長時(shí)間缺血后的再灌注卻可導(dǎo)致更為嚴(yán)重的損傷,即心臟缺血/再灌注損傷(Ischemia and reperfusion Injury,I/R),I/R的概念于1960年被Jennings等第一次提出。I/R是冠脈再通術(shù)(溶栓、PTCA或搭橋術(shù))后的重要的并發(fā)癥。如何做到既保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流灌注,又減輕甚至消除再灌注損傷的發(fā)生

2、便成為缺血性心臟病防治中的重要課題。有效防治再灌注損傷的重要前提是闡明其發(fā)病機(jī)制。心肌在遭受一次或多次反復(fù)的短暫缺血再灌注后,會(huì)表達(dá)出一種對(duì)隨后而來的一次長時(shí)間的嚴(yán)重缺血損傷的抵抗能力的提高,這種現(xiàn)象稱為缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IPC),IPC于1986年首次被Murry等發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過預(yù)適應(yīng)的心肌能夠縮小心肌梗死的面積,改善心肌收縮力,保護(hù)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮和心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),保護(hù)微循環(huán),降低再灌注導(dǎo)致的

3、心律失常的發(fā)生率,更快地使心肌從再灌注誘導(dǎo)的心肌頓抑中恢復(fù),是一種內(nèi)源性自我保護(hù)方式。
　　 Rho-kinase是一類絲.蘇氨酸蛋白家族,可作為小G蛋白R(shí)hoA的直接下游效應(yīng)物,參與多種細(xì)胞生物功能,如:平滑肌收縮、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組裝、細(xì)胞黏附、移動(dòng)、基因表達(dá)等。Rho-kinase以兩種同源性極高的異構(gòu)體形式存在:ROCK-1(或ROKβ、p160ROCK)和ROCK-2(或ROKα)。ROCK-1位于18號(hào)染色體,含有1

4、354個(gè)氨基酸,ROCK-2位于12號(hào)染色體,含有1388個(gè)氨基酸。二者有65％的同源性,而在激酶結(jié)構(gòu)域則有92％的同源性。Y-27632和fasudil是ROCK的選擇性抑制劑,作用于其ATP依賴激酶區(qū),可同時(shí)抑制ROCK-1和ROCK-2。Rho-kinase可以介導(dǎo)下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng),已有20多種下游蛋白被發(fā)現(xiàn)。如:MLC、MYPT-1、ERM、PTEN、IRS1、NHE1、LIM激酶等。最具特征意義的Rho-kina

5、se底物是MLC(myosin light chain)和MYPT-1(myosin binding subunit of MLCphosphorylation,MLC磷酸酶的肌球蛋白結(jié)合亞基)。Rho-kinase可以通過作用于MLC或MYPT1來增加胞漿內(nèi)MLC的磷酸化,促進(jìn)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn),Rho-kinase參與了變異性心絞痛、心衰、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病。初步研究表明Rho-kina

6、se在心臟I/R損傷中活性增加,而在IPC中活性可能降低,但是其中發(fā)生機(jī)制卻遠(yuǎn)未清楚。例如Rho-kinase調(diào)控哪些細(xì)胞因子,通過哪些信號(hào)途徑發(fā)揮作用,以及在IPC中Rho-kinase活性是否會(huì)降低,Rho-kinase活性降低的機(jī)制如何,這些問題構(gòu)成了本研究課題的內(nèi)容。在本研究中,我們擬建立大鼠I/R和IPC模型,明確Rho-kinase活性在IPC和I/R中是否不同,Rho-kinase對(duì)心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡的影響以及對(duì)細(xì)

7、胞凋亡有關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)；明確IPC中ERK-MAPK是否能通過下調(diào)Rho-kinase活性起到抗心肌細(xì)胞凋亡作用。通過以上研究,進(jìn)一步明確Rho-kinase在心臟I/R.和IPC中所起的作用及其機(jī)制。這對(duì)于闡明I/R和IPC的發(fā)病機(jī)制,為心肌保護(hù)提供新的治療途徑具有重要的意義。
　　 本研究共分三部分進(jìn)行:
　　 第一部分 Rho-kinase在心臟缺血再灌注損傷和心肌缺血預(yù)適應(yīng)中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；

8、　　 第二部分心臟缺血再灌注損傷中Rho-kinase對(duì)AIF的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制；
　　 第三部分心肌缺血預(yù)適應(yīng)中ERK對(duì)Rho-kinase的調(diào)節(jié)。
　　 第一部分 Rho-kinase在心臟缺血再灌注損傷和心肌缺血預(yù)適應(yīng)中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　 研究目的：
　　 本部分研究擬建立大鼠I/R和IPC模型,應(yīng)用藥物fasudil抑制Rho-kinase活性,測定心肌梗死面積、心肌細(xì)胞的凋亡,明確

9、Rho-kinase在心臟I/R和IPC中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.大鼠心臟I/R和IPC模型的建立和分組:采用開胸結(jié)扎和松開冠狀動(dòng)脈的方法建立大鼠心臟I/R和IPC型。分為以下四組:對(duì)照組(18只)、I/R組(18只)、I/R+fasudil組(18只)和IPC組(18只)。
　　 2.Rho-kinase活性的檢測:Rho-kinase的活性通過Western檢測其特異性底物MYPT-1的磷酸化水

10、平來表示。
　　 3.心肌梗死面積檢測:采用伊文思藍(lán)染色鑒別非缺血區(qū)與缺血危險(xiǎn)區(qū)(AAR),硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色鑒別梗死心肌與非梗死心肌。以稱重法計(jì)算心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)(伊文思藍(lán)未染區(qū)),梗死區(qū)(NBT未染區(qū))的重量,心肌梗死范圍的大小以梗死區(qū)重量占缺血危險(xiǎn)區(qū)重量的百分比表示。
　　 公式為:心肌梗死范圍=NBT未染區(qū)/伊文思藍(lán)未染區(qū)×100％
　　 4.大鼠心肌細(xì)胞凋亡的檢測:采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末

11、端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒檢測各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。按照試劑盒說明書操作。標(biāo)記前用DNA酶處理切片做陽性對(duì)照,用標(biāo)記液代替TdT酶反應(yīng)液做陰性對(duì)照。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野(×400倍),計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)和所有細(xì)胞個(gè)數(shù),以凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù)反映各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。
　　 5.Caspase-3活性的檢測:Caspase-3的活性通過Western檢測其裂解產(chǎn)物cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平來表示

12、。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.p-MYPT-1(磷酸化的MYPT-1)在I/R中大量表達(dá),而在IPC中活性降低。在I/R中應(yīng)用Rho-kinase抑制劑fasudil后,p-MYPT-1表達(dá)降低:對(duì)照組中只有微弱的p-MYPT-1表達(dá)。說明Rho-kinase在I/R中活性增加,而IPC和fasudil均抑制了Rho-kinase的活性。
　　 2.Rho-kinase活性的抑制可減少大鼠心肌梗死面積:I/R組

13、大鼠的心肌梗死面積占危險(xiǎn)區(qū)心肌面積的60.3±4.08％,I/R+fasudil組大鼠的心肌梗死面積/AAR減少至38.62±2.66％,說明在I/R大鼠中抑制Rho-kinase活性后能顯著減少心肌梗死面積。在IPC中大鼠的心肌梗死面積降至29.16±1.08％,說明IPC可能通過降低Rho-kinase活性而明顯縮小心肌梗死面積。
　　 3.Rho-kinase活性的抑制可減少大鼠心肌細(xì)胞凋亡率:在對(duì)照組大鼠心肌中無TUNE

14、L染色陽性細(xì)胞。在I/R組大鼠心肌中,TUNEL染色陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞的33.87±1.57％,說明I/R可引起心肌細(xì)胞凋亡增加。在I/R+fasudil組大鼠心肌中,TUNEL染色陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞的17.05±4.22％,說明在I/R大鼠中抑制Rho-kinase活性能減少心肌細(xì)胞凋亡率。在IPC中,細(xì)胞凋亡率為17.29±0.84％,說明IPC可能通過降低Rho-kinase活性而明顯降低心肌細(xì)胞凋亡率。
　　 4.Rho

15、-kinase活性的抑制降低Caspase-3活性:在I/R中cleaved-Caspase-3大量表達(dá),在IPC和I/R+fasudil組中其表達(dá)分別減少了約65.3％和58.5％,說明IPC和fasudil在抑制Rho-kinase活性同時(shí)抑制了Caspase-3的活性。
　　 結(jié)論：
　　 1.在大鼠心肌I/R損傷中Rho-kinase活性明顯增加,加重了心臟的損傷、增加了心肌細(xì)胞凋亡。
　　 2.在大鼠心

16、肌I/R損傷中抑制Rho-kinase活性后能減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞的凋亡率,減輕心肌細(xì)胞的損傷程度。
　　 3.IPC中Rho-kinase活性降低,心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡減輕,具有心臟保護(hù)作用。
　　 第二部分心臟缺血再灌注損傷中Rho-kinase對(duì)AIF的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制
　　 研究目的：
　　 探討在大鼠心臟I/R中Rho-kinase對(duì)AIF的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制。(Rho-kinase/JN

17、K/AIF信號(hào)通路在心臟I/R損傷中的作用)
　　 研究方法：
　　 1.大鼠心臟I/R損傷模型的建立,分為以下5組:對(duì)照組(18只)、I/R+NS組(18只)、I/R+fasudil組(18只)、I/R+SP600125(JNK抑制劑)組(18只)和I/R+DMSO組(18只)。
　　 2.心肌梗死面積檢測,計(jì)算梗死心肌面積占危險(xiǎn)區(qū)(AAR)心肌面積百分比。
　　 3.TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。