TGF-β1誘導(dǎo)的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化在人膀胱尿路上皮癌中的研究.pdf

1、第一部分構(gòu)建經(jīng)TGF—β1誘導(dǎo)的EMT化的膀胱尿路上皮細(xì)胞癌T24細(xì)胞并驗(yàn)證
　　目的：探索利用TGF—β1因子提高人膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞系EMT水平的最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，并進(jìn)行基因表達(dá)、生物學(xué)行為等的驗(yàn)證。
　　方法：培養(yǎng)人膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞系并傳代，使用不同濃度的TGF—β1因子進(jìn)行誘導(dǎo)，然后在不同時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞形態(tài)變化進(jìn)行觀察。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對上皮細(xì)胞—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物（如:Vimentin、M

2、MP2、E—cadherin、slug、 ZEB1等等）的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。利用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)、Transwell小室遷移試驗(yàn)等對誘導(dǎo)前后細(xì)胞的侵襲、穿透、遷移等能力進(jìn)行了檢測和評估，進(jìn)一步驗(yàn)證TGF—β1因子的最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。
　　結(jié)果：濃度為10ng/ml的TGF—β1誘導(dǎo)T24細(xì)胞36h后，T24細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)提示有上皮細(xì)胞間質(zhì)化的發(fā)生;同時(shí)，EMT標(biāo)志性基因的表達(dá)水平亦出現(xiàn)相應(yīng)改變，如:間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin

3、和MMP2表達(dá)水平上調(diào)，E—cadherin等上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，slug、ZEB1等促EMT因子表達(dá)上調(diào);另外，細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示，10ng/ml的TGF—β1因子誘導(dǎo)前后兩組的平均愈合面積（百分比）差異有顯著性(0.81 vs1，P＜0.05);同樣，Transwell小室遷移試驗(yàn)檢測T24—N.C.組和T24—TGF—β1組細(xì)胞的侵襲情況發(fā)現(xiàn)10ng/ml T24—TGF—β1組細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，(每視野平均細(xì)胞數(shù)54.6

4、vs97.65，P＜0.05)。
　　結(jié)論：膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞經(jīng)濃度為10ng/ml的TGF—β1因子誘導(dǎo)36小時(shí)后其細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)較為明顯的上皮細(xì)胞間質(zhì)化改變。并且，其誘導(dǎo)后細(xì)胞的基因呈現(xiàn)EMT化的相關(guān)表達(dá)，其細(xì)胞的侵襲、穿透、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力有著明顯的增強(qiáng)。
　　第二部分 TGF—β1誘導(dǎo)的EMT化的膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞的mRNA和microRNA的表達(dá)譜
　　目的：獲得TGF—β1因子誘導(dǎo)的膀胱尿路上皮癌

5、T24細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜和mRNA的表達(dá)譜。
　　方法：對TGF—β1誘導(dǎo)的EMT化的膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞的總RNA進(jìn)行提取，并予以質(zhì)檢。質(zhì)檢合格后進(jìn)行RNA純化、孵育加尾、標(biāo)記生物素?zé)晒?、芯片雜交、清洗染色、掃描芯片、數(shù)據(jù)提取以及數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等，所用芯片為目前較為先進(jìn)GeneChip(R)PrimeViewTMHuman Gene Expression Array芯片以及Multispecies miRNA2.0ar

6、ray芯片。然后注冊并利用分子功能注釋3.0系統(tǒng)(Capital Bio(R)Molecule Annotation System V3.0，MAS3.0)對芯片結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析（如GO，KEGG pathway，靶基因預(yù)測，列聯(lián)分析等等）。
　　結(jié)果：經(jīng)10ng/ml TGF—β1因子誘導(dǎo)36小時(shí)后的膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞共有包括SPC25等在內(nèi)的1062個(gè)基因的表達(dá)下調(diào)，以及包括ASNS基因在內(nèi)的572個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)。經(jīng)K

7、EGG pathway平臺分析發(fā)現(xiàn)，共有包括Cell cycle等在內(nèi)的40條信號傳導(dǎo)通路與之密切相關(guān)。利用GO數(shù)據(jù)庫對該基因集進(jìn)行闡釋，共運(yùn)算出1250條相關(guān)的GO信息，其中多與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、黏附、代謝調(diào)控、免疫反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)等密切相關(guān)。microRNA芯片掃描結(jié)果則顯示，miR—1184等在內(nèi)的6個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào)，而以及包括miR—21等在內(nèi)的8個(gè)microRNA的表達(dá)上調(diào)。MicroRNA芯片與mRNA芯片列聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)包括mic

8、roRNA—21、microRNA—146a以及microRNA—638在內(nèi)的3個(gè)microRNAs與部分差異表達(dá)的基因的表達(dá)趨勢存在相關(guān)，其中包括ACVR1C、NOG、THBS1、TUBB2A等基因與EMT過程相關(guān)性較高。
　　結(jié)論：獲得了TGF—β1誘導(dǎo)的膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞系EMT過程中的mRNA以及microRNA差異表達(dá)譜;T24細(xì)胞系EMT過程中涉及到包括Cell cycle等在內(nèi)的多個(gè)分子信號通路，這些分子信號通

9、路多與細(xì)胞的生長、連接、黏附、運(yùn)動(dòng)、侵襲等生物學(xué)行為相關(guān);miRNA—21、miRNA—146a以及miRNA—638很可能通過靶向調(diào)控ACVR1C等基因的方式在T24細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮作用。
　　第三部分對TGF—β1因子誘導(dǎo)的膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞的芯片篩選結(jié)果的驗(yàn)證
　　目的：對生物信息學(xué)分析的基因芯片及microRNA芯片的結(jié)果進(jìn)行初步的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，以期提高該結(jié)果的可信性。
　　方法：利用microRNA

10、mimics以及microRNA inhibitor進(jìn)行microRNA的過表達(dá)和抑制表達(dá)。Real-time PCR試驗(yàn)驗(yàn)證三個(gè)microRNA的表達(dá)趨勢是否與芯片結(jié)果相同、mimics和inhibitor的表達(dá)效果、以及對靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。劃痕試驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞是否發(fā)生相應(yīng)的侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為改變。
　　結(jié)果：PCR結(jié)果顯示，microRNA—21、microRNA—146a以及microR

11、NA—638等microRNAs的表達(dá)趨勢與芯片結(jié)果相同，microRNA的mimics和inhibitor達(dá)到預(yù)期效果，并且這些microRNAs的靶基因表達(dá)與生物信息學(xué)分析結(jié)果相同;劃痕試驗(yàn)顯示除陰性對照組(N.C.)外的mimics組侵襲能力明顯增強(qiáng)，inhibitor組的侵襲能力有所減弱。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)提示除陰性對照組(N.C.)外的mimics組遷移轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)，inhibitor組的遷移轉(zhuǎn)移能力有所減弱。