甘草酸18H差向異構(gòu)體及其水解產(chǎn)物對Ⅱ相解毒酶的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、祖國醫(yī)學(xué)很早就認(rèn)識到甘草具有調(diào)和諸藥和解毒的作用，認(rèn)為甘草可以緩解其它藥物的毒性和烈性。中藥方劑中很多配伍甘草以緩其性。大量臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究均證明了甘草“解百藥毒”這一傳統(tǒng)認(rèn)識的科學(xué)性。甘草酸(glycyrrhizicacid，GL)是甘草的主要活性成分，其鉀、鈣鹽為甘草甜素(glycyrrhizin)，水解后產(chǎn)生二分子葡萄糖醛酸和一分子甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)。由于其母核18位手性碳原子C-H鍵(18

2、H)的構(gòu)型不同，因此甘草酸存在兩種差向異構(gòu)體，即18α-甘草酸（18α-GL）和18β-甘草酸(18β-GL)，兩者水解之后可生成相應(yīng)的18α-甘草次酸(18α-GA)和18β-甘草次酸(18β-GA)。由于在我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的異甘草酸鎂“手性肝藥”在2006年上市，甘草酸異構(gòu)體的差異日漸受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)18β-GL能夠誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)，本文從Ⅱ相解毒酶的角度，研究了甘草提取物、甘草酸18H差向異構(gòu)體及其

3、水解產(chǎn)物對Ⅱ相解毒酶的影響及其機(jī)制的研究。
　　 目的：
　　 通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究甘草提取物及甘草酸18位差向異構(gòu)體及其水解產(chǎn)物對UGT1A、UGT2B及其同工酶UGT1A1和UGT1A6和GSTπ的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平mRNA的影響，探討其對Ⅱ相解毒酶的作用是否具有立體選擇性;擬初步證實(shí)甘草提取物及甘草酸18位差向異構(gòu)體及其水解產(chǎn)物對Ⅱ相解毒酶誘導(dǎo)作用及其機(jī)制的研究;通過研究甘草酸制劑對對乙酰氨基酚藥動學(xué)的影響，初步探討

4、甘草酸制劑與Ⅱ相解毒酶UGT底物在臨床上可能發(fā)生的相互作用。
　　 方法：
　　 1.甘草提取物和甘草酸18H差向異構(gòu)體分別從不同濃度和不同時(shí)間對大鼠體內(nèi)Ⅱ相解毒酶的影響
　　 通過從不同濃度甘草提取物(90、180、360 mg·kg-1)以及18α-GL和18β-GL（12.5、25、50 mg·kg-1）和不同時(shí)間（3、6、12天）對大鼠進(jìn)行灌胃誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，用芯片陣列免疫組化技術(shù)手段實(shí)驗(yàn)考察試驗(yàn)藥物對Ⅱ相解毒

5、酶UGT1A和UGT2B及GSTπ的影響。
　　 2.甘草提取物、甘草酸18H差向異構(gòu)體及其水解產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)對Ⅱ相代謝解毒中、高三個(gè)濃度為（1、10、100μM）。用熒光素報(bào)告基因法檢測甘草提取物及其主要成分18α、β-GL和18α、β-GA對報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 6.甘草酸制劑對對乙酰氨基酚藥動學(xué)的影響
　　 采用隨機(jī)開放，三周期交叉自身對照的拉丁方設(shè)計(jì)，12名受試者隨機(jī)等分為3組，分別為甘草酸二胺

6、膠囊組，即試驗(yàn)組;葡醛內(nèi)酯組，即對照組;以及安慰劑組。洗脫期為2周。受試者于服藥前（空白）和服藥后0.16、0.33、0.5、0.75、1.0、1.5、2、3、4、6、8、10、12和24小時(shí)點(diǎn)前臂靜脈血4mL。分離血漿，立即置-70℃冰箱中保存，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)及時(shí)進(jìn)行測定。尿樣收集于給藥前及給藥后0～2，2～4，4～6，6～8，8～12，12～24 h各時(shí)段尿液收集于一容器中，記錄總量并留取標(biāo)本，于-70℃保存?zhèn)溆谩２捎肏PLC-M

7、S/MS法測定血漿中對乙酰氨基酚及其結(jié)合物的濃度。使用DAS2.1.1軟件計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)，SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果與結(jié)論：
　　 1.肝組織的芯片陣列免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)甘草提取物及18α-GL和18β-GL對Ⅱ相解毒酶UGT1A和UGT2B誘導(dǎo)作用成劑量依賴性和時(shí)間依賴性，對谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTπ也有誘導(dǎo)作用，但時(shí)間依賴性和劑量依賴性不明顯。
　　 2研究結(jié)果表明，大鼠經(jīng)實(shí)驗(yàn)

8、藥物誘導(dǎo)七天后，甘草提取物對UGT1A、UGT1A1、UGT1A6、UGT2B有明顯的誘導(dǎo)作用。對GSTπ有誘導(dǎo)作用，但作用不明顯。發(fā)現(xiàn)甘草的主要成分18α-GL和18β-GL對UGT及其部分同工酶UGT1A1、UGT1A6有誘導(dǎo)作用，其中18β-GL對Ⅱ相酶的誘導(dǎo)作用表現(xiàn)更加明顯。18α-GA對UGT2B有明顯的誘導(dǎo)作用，與18α-GA相比，18β-GA對UGT1A及其部分同工酶UGT1A1和UGT1A6的誘導(dǎo)作用更加明顯。甘草酸和甘

9、草次酸以及其差向異構(gòu)體的在很多相互比較的研究中都有一定的差異，兩者在代謝方面的區(qū)別應(yīng)受到重視。
　　 3.甘草提取物在HepG2細(xì)胞中對UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平mRNA的表達(dá)有明顯的增強(qiáng)作用，18α、β-GL對UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá)有增強(qiáng)作用，其中18β-GL對UGT1A1和UGT1A6蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平有顯著的增

10、強(qiáng)作用，這點(diǎn)與大鼠肝組織中報(bào)道的18β-GL較18α-GL對Ⅱ相酶誘導(dǎo)作用更明顯較為一致;18α-GA和18β-GA在細(xì)胞水平對UGT1A、UGT2B、UGT1A1、UGT1A6和GSTπ蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)比在大鼠肝組織中更加明顯，尤其18β-GA在轉(zhuǎn)錄水平對UGT1A、UGT1A1、UGT1A6、UGT2B和GSTπ的mRNA表達(dá)量都具有明顯的增加作用，在蛋白表達(dá)水平對UGT1A、UGT1A1也有明顯增強(qiáng)作用。18β-GL和18β

11、-GA對Ⅱ相酶的誘導(dǎo)作用可能具有同向性。
　　 4.甘草提取物、18α、β-GL和18α、β-GA通過核受體CAR或PXR對UGT1A1和UGT1A6轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生影響，在高劑量時(shí)這種影響更加明顯。另外18α、β-GL對這種轉(zhuǎn)錄活性的影響有一定的差異性，尤其是18α-GL除了高劑量有較強(qiáng)的作用外，低、中劑量通過核受體CAR或PXR對UGT1A1和UGT1A6轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生影響不是很明顯，然而18β-GL低、中、高劑量通過核受體CAR

12、或PXR對UGT1A1和UGT1A6轉(zhuǎn)錄活性的影響均有顯著的增強(qiáng)作用。這也從作用機(jī)制方面解釋了本課題前面研究報(bào)道的18β-GL對Ⅱ相解毒酶UGT有顯著誘導(dǎo)作用真正原因。18α、β甘草次酸也通過核受體CAR或PXR對UGT1A1和UGT1A6轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生影響，但僅在高劑量時(shí)這種作用較為明顯?？傊?，甘草提取物、18α、β-GL和18α、β-GA通過誘導(dǎo)核受體CAR或PXR，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)下游UGT1A1和UGT1A6等一系列解毒靶基因的表達(dá)

13、，這可能是甘草解百毒的重要作用機(jī)制之一，下一步可以從PXR/CAR介導(dǎo)解毒酶與外排泵的聯(lián)合作用機(jī)制（如P-gp-UGT或MRP-UGT共轉(zhuǎn)運(yùn)體系）進(jìn)行研究，以探明甘草解百毒真正聯(lián)合機(jī)理。
　　 5.對乙酰氨基酚藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，對乙酰氨基酚的藥動學(xué)參數(shù)(AUC0-24，AUC0-∞，Cmax)在試驗(yàn)組和安慰組之間有較大差異，且AUC0-∞有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)也觀察到對乙酰氨基酚的總體消除半衰期有所加快。在我們也比較對

14、乙酰氨基酚葡萄糖醛酸結(jié)合物(PG)血藥濃度在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的變化，發(fā)現(xiàn)甘草酸二胺膠囊組中的PG主要藥動學(xué)參數(shù)與安慰組相比有顯著變化，尤其是AUC0-24，AUC0-∞都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與安慰組相比，葡醛內(nèi)酯試驗(yàn)組在整個(gè)過程中對對乙酰氨基酚及其結(jié)合物的主要藥動學(xué)參數(shù)有所影響，但變化不大。據(jù)此我們推測甘草酸二胺膠囊組可能誘導(dǎo)Ⅱ相酶UGT，從而加快底物對乙酰氨基酚的代謝，使結(jié)合物的生成增加，進(jìn)而促進(jìn)排泄。葡醛內(nèi)酯組結(jié)果顯示，增加葡

15、萄糖醛酸能在一定程度加快UGT底物的代謝和排泄，但起主要作用的可能還是由于誘導(dǎo)了Ⅱ相結(jié)合酶UGT所致。本試驗(yàn)中也有些APAP和PG主要藥動學(xué)參數(shù)變化不明顯，可能是我們誘導(dǎo)時(shí)間太短，也有可能是受試者體內(nèi)影響底物對乙酰氨基酚代謝UGT同工酶的UGT1A6、UGT1A1和UGT1A9的多態(tài)性從而對有些藥動學(xué)參數(shù)產(chǎn)生了影響，因此下步實(shí)驗(yàn)可以從擴(kuò)大樣本量，基因分型等角度來進(jìn)一步研究甘草酸制劑對Ⅱ相解毒酶的誘導(dǎo)作用。
　　 本研究對甘草提取

16、物、甘草酸18位差向異構(gòu)體及其水解產(chǎn)物對UGT和GST的影響進(jìn)行了探討，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)藥物不同程度地對UGT1A，UGT2B及部分同工酶UGT1A1、UGT1A6，GSTπ有誘導(dǎo)作用;其中甘草提取物和18β-GL對Ⅱ相解毒酶的有顯著誘導(dǎo)作用，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)藥物通過上調(diào)上游因子PXR和CAR信號通路從而增加下游UGT1A1和UGT1A6等一系列解毒基因的表達(dá)，可能這個(gè)信號通路是甘草解毒的重要機(jī)理之一，在比較差向異構(gòu)體對Ⅱ相結(jié)合酶UGT