BDNF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化神經(jīng)元細(xì)胞研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是存在于骨髓中由中胚層發(fā)育的一類非造血干細(xì)胞,具有多向分化潛能,不僅能分化為造血細(xì)胞,還能分化成多種造血以外的組織細(xì)胞,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞。MSCs在多個領(lǐng)域,如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。
　　 目的:了解大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)特性,探討MSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增的規(guī)律和特點(diǎn)

2、。建立SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
　　 方法:1.原代培養(yǎng),取一月齡SD大鼠股骨和脛骨,采用全骨髓培養(yǎng)法,以L-DMEM完全培養(yǎng)基沖出骨髓過濾后直接接種于培養(yǎng)瓶中,3天后首次換液,以后每3天換液一次。至細(xì)胞融合達(dá)80％以上時,進(jìn)行傳代。2.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增的研究,取第1、4、7、10、13代細(xì)胞,觀察其細(xì)胞生長曲線及貼壁率。3.大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定,取第4代細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測。
　　

3、 結(jié)果:1.貼壁篩選法,通過多次換液可以分離、純化MSCs,該法簡單、方便、效果好。2.MSCs在體外培養(yǎng)中有很強(qiáng)的增殖能力,10代以前的細(xì)胞形態(tài)較一致,增殖能力強(qiáng),隨傳代次數(shù)的增加,增殖能力減弱,形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化。細(xì)胞生長的第1、4、7、10、13代的貼壁率變化規(guī)律基本相同,無顯著區(qū)別。傳代后細(xì)胞貼壁率隨時間延長而增高。3.MSCs的表面標(biāo)志抗原呈現(xiàn)多樣性的特征,MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD34、CD45,說明MSCs非造血

4、類細(xì)胞；而其表達(dá)CD90、CD44,說明:MSCs的表面標(biāo)志具有非單一性的特性。它表達(dá)了間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗采用骨髓直接培養(yǎng),貼壁篩選法來分離培養(yǎng)MSCs,方法簡單,效果亦可靠,通過數(shù)代的傳代擴(kuò)增就能獲得高純度、高數(shù)量的MSCs,以滿足組織工程實(shí)驗研究的需要。
　　 目的:1.構(gòu)建pEGFP-N1-BDNF質(zhì)粒。2.獲得到穩(wěn)定表達(dá)BDNF的MSCs,并轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSC

5、s),觀察其在MSCs內(nèi)的表達(dá)。
　　 方法:用RT—PCR法從大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中擴(kuò)增出帶有XhoⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)的BDNF基因片段,將BDNF基因片段克隆到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因真核表達(dá)載體pEGFP—N1上,構(gòu)建pEGFP—N1-BDNF質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)染將pEGFP—N1-BDNF轉(zhuǎn)染入大鼠MSCs。
　　 結(jié)果:pEGFF-N1-BDNF真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,熒光顯微鏡下觀察,pEGFP-N1

6、-BDNF表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到MSCs12h后可見BDNF融合蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:1.成功的構(gòu)建pEGFP-N1-BDNF質(zhì)粒。2.pEGFP-N1-BDNF質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)染真核細(xì)胞HEK293細(xì)胞,證明BDNF-EGFP融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)?？梢栽谡婧思?xì)胞表達(dá)。3.通過電轉(zhuǎn)染和抗性篩選我們獲得到了穩(wěn)定表達(dá)BDNF的MSCs。
　　 目的:1.采用β-硫基乙醇(β-ME)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)作為誘導(dǎo)劑,對骨髓間充

7、質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)進(jìn)行體外誘導(dǎo)實(shí)驗。探討β-ME和bFGF體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)制。2.探討B(tài)DNF基因修飾對MSCs分化神經(jīng)元細(xì)胞的影響。
　　 方法:1.MSCs向神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化,取P4代的MSCs和BDNF-MSCs,分別以2×104/ml濃度接種于24孔板內(nèi),待細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合時,分別加入β-硫基乙醇(β-ME)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF),倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化

8、。2.細(xì)胞免疫熒光鑒定,采用細(xì)胞免疫熒光方法,對以上兩組細(xì)胞誘導(dǎo)后5h后檢測神經(jīng)元標(biāo)志物TuJ1的表達(dá)情況,熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。3.MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞陽性率比較,熒光顯微鏡下在兩組細(xì)胞隨機(jī)取300個細(xì)胞,計數(shù)TuJ1反應(yīng)陽性細(xì)胞個數(shù),檢驗各組不同時間點(diǎn)的差異,以及每個時間點(diǎn)各組間的差異。
　　 結(jié)果:1.第4代MSCs加入誘導(dǎo)劑后可分化為神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞?？梢姽庀掠^察:前者細(xì)胞體積較小數(shù)量較少,常有數(shù)個短小

9、突起和一個較長的突起,呈典型的雙極、多極或錐形,具有較強(qiáng)的折光性；后者細(xì)胞體積較大,細(xì)胞突起較多且粗,有些形態(tài)呈星狀,有許多突起呈放射狀伸出,平鋪在培養(yǎng)皿上。2.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果示細(xì)胞誘導(dǎo)后5h,部分細(xì)胞TuJ1反應(yīng)陽性,為神經(jīng)元細(xì)胞。3.兩組MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞陽性率比較,BDNF-MSCs組分化為神經(jīng)元細(xì)胞的陽性率高于MSCs組,并具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:1.在體外MSCs在誘導(dǎo)劑bFGF和β-ME的作用下可分化為