乙型肝炎病毒感染轉(zhuǎn)歸及疫苗免疫應(yīng)答影響因素研究.pdf

1、前言：
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一個(gè)世界性的衛(wèi)生問(wèn)題，它能引起肝炎、肝硬化、甚至肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。我國(guó)是乙肝病毒感染大國(guó)，目前我國(guó)1-59歲人群乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)攜帶率為7.18％，據(jù)此推算，我國(guó)現(xiàn)有的慢性HBV感染者約為9300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)。
　　不同個(gè)體感染HBV后，結(jié)局

2、不盡相同。成年人感染HBV后約90％-95％的感染者可自發(fā)清除病毒而免受疾病侵襲。另外，約5％-10％的HBV感染者會(huì)轉(zhuǎn)為慢性感染。影響HBV感染后臨床轉(zhuǎn)歸的因素非常復(fù)雜，包括感染年齡、病毒基因型、宿主基因型等。近年來(lái)關(guān)于編碼多種細(xì)胞因子如干擾素、白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子等的基因多態(tài)性與HBV感染結(jié)局的相關(guān)性研究成為熱點(diǎn)并且已經(jīng)得到證實(shí)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因組學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一大批與HBV感染相關(guān)的基因，并且部分HBV感染相關(guān)的

3、基因已經(jīng)得到精確的定位和功能研究。這些研究均提示，個(gè)體間某些細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)分子的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)可能是導(dǎo)致機(jī)體免疫功能狀態(tài)差異的重要因素，并最終影響著HBV感染的不同臨床轉(zhuǎn)歸。
　　近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示固有免疫分子和固有免疫應(yīng)答在抗病毒感染中發(fā)揮重要作用，其中三基序(tripartite motif, TRIM)蛋白家族是當(dāng)前抗病毒固有免疫中的研究熱點(diǎn)之一

4、。TRIM22分子新近被證實(shí)具有抑制乙肝病毒的作用而受到關(guān)注。對(duì)于乙肝病毒感染者而言，一旦激發(fā)體內(nèi)的TRIM22分子，攜帶者便可誘發(fā)相應(yīng)免疫應(yīng)答，抑制病毒復(fù)制，清除體內(nèi)的乙肝病毒，這就說(shuō)明了在一定程度上TRIM22分子起到了控制乙肝病毒“開(kāi)關(guān)”的作用。關(guān)于TRIM22基因SNP是否影響了機(jī)體對(duì)HBV的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致HBV感染的不同臨床轉(zhuǎn)歸，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　乙肝疫苗接種是預(yù)防HBV感染的有效措施，我國(guó)目前對(duì)新生兒實(shí)行乙

5、肝疫苗免疫接種，已使5歲以下兒童的HBsAg攜帶率降至0.96％。然而，未免疫人群及高危人群仍然處于乙肝病毒感染的威脅中。另外，盡管接受標(biāo)準(zhǔn)的乙肝疫苗免疫接種，仍有4％-10％的健康受試者不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)性抗體。如何對(duì)這些人群采取有效措施預(yù)防HBV感染仍是面臨的重要任務(wù)。
　　鋅作為一種必須的微量元素，參與包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等許多病理生理過(guò)程，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育及免疫功能的維持中發(fā)揮重要作用。2003年，WHO就將鋅缺乏認(rèn)定

6、為引發(fā)疾病的首要危險(xiǎn)因素之一。有數(shù)據(jù)顯示9.5％的美國(guó)人和33.1％的東南亞人存在鋅攝入量不足，尤其在妊娠期，由于對(duì)鋅的需求量劇增，孕婦和胎兒更容易出現(xiàn)鋅缺乏。而鋅缺乏是造成哺乳動(dòng)物免疫功能缺陷最常見(jiàn)的原因之一，妊娠期鋅缺乏不僅影響母體的免疫功能，而且導(dǎo)致新生兒免疫功能缺陷。鋅缺乏可以降低流感疫苗、霍亂疫苗等多種疫苗的免疫接種效力。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于妊娠期鋅缺乏對(duì)子代接種乙肝疫苗免疫應(yīng)答影響的相關(guān)研究報(bào)道。
　　本研究從機(jī)體對(duì)H

7、BV免疫應(yīng)答的角度，探討了TRIM22單核苷酸基因多態(tài)性與HBV感染不同臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，為闡明HBV感染者不同臨床轉(zhuǎn)歸的免疫遺傳機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)感染者的預(yù)后判斷及HBV的防治策略提供科學(xué)依據(jù);同時(shí)從機(jī)體對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的角度對(duì)妊娠期鋅缺乏與仔鼠乙肝疫苗免疫效力之間的關(guān)系和機(jī)制進(jìn)行研究，可以為明確乙肝疫苗免疫后無(wú)應(yīng)答或弱應(yīng)答的機(jī)制，探討妊娠期預(yù)防性補(bǔ)鋅策略的可行性，以期改善和提高乙肝疫苗接種效果提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：

8、
　　以293例慢性乙型肝炎患者、224例HBsAg攜帶者和248例自限性HBV感染者為研究對(duì)象，應(yīng)用血生物化學(xué)方法檢測(cè)ALT、AST、TBiL、ALB、PTA、CHE水平，應(yīng)用HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HBVDNA水平，從各組受試對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取基因組DNA，針對(duì)TRIM22編碼基因目的區(qū)域RING區(qū)和SPRY區(qū)設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI3700型DNA自動(dòng)化測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序分析，計(jì)算基因型頻率及等位

9、基因頻率，應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　以飼喂不同含鋅量飼料的BALB/c孕鼠子代作為研究對(duì)象，仔鼠出生后24小時(shí)內(nèi)及第2周和第4周末進(jìn)行乙肝疫苗全程免疫接種。末次接種兩周后處死仔鼠，取血液標(biāo)本，應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)鋅含量，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HBsAg特異性抗體及其亞型。制備脾淋巴細(xì)胞，檢測(cè)HBsAg特異性增殖應(yīng)答。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子確定淋巴細(xì)胞分類(lèi)及數(shù)量，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子IFN-γ和IL-4與C

10、D4+和CD8+T細(xì)胞的共表達(dá)水平，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)脾單細(xì)胞懸液培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4濃度。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、TRIM22基因RING區(qū)及SPRY區(qū)單核苷酸基因多態(tài)性檢測(cè)
　　1、研究對(duì)象的人口學(xué)特征及環(huán)境危險(xiǎn)因素分布
　　慢性肝炎組的年齡及飲酒者的比例顯著高于HBsAg攜帶組;兩組在性別、吸煙方面無(wú)顯著差異。慢性肝炎組與自限性感染組在年齡、吸煙和飲酒方面無(wú)顯著差異;慢性肝炎組男性患者的比例顯

11、著高于自限性感染組。
　　2、TRIM22基因RING區(qū)及SPRY區(qū)測(cè)序結(jié)果
　　對(duì)TRIM22編碼基因RING區(qū)及SPRY區(qū)測(cè)序后共檢測(cè)到3處SNP位點(diǎn)，分別為RING區(qū)-336G/A;RING區(qū)-364T/C位點(diǎn)和SPRY區(qū)-7C/T。RING區(qū)-364T/C位點(diǎn)檢測(cè)到TT、TC、CC三種基因型，-336G/A位點(diǎn)檢測(cè)到GG及GA兩種基因型，-7C/T位點(diǎn)檢測(cè)到CC及CT兩種基因型。
　　二、TRIM22基因RIN

12、G區(qū)及SPRY區(qū)的SNP與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性研究
　　1、慢性感染者基因型與HBVDNA載量相關(guān)
　　將慢性肝炎組與HBsAg攜帶組合并進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在HBV慢性感染者中，-364T/C位點(diǎn)CC基因型的病毒載量高于TC+CC基因型者。
　　2、慢性肝炎組基因型與轉(zhuǎn)氨酶水平相關(guān)性
　　慢性肝炎組中，-364T/C位點(diǎn)CC基因型的患者ALT、AST水平低于TC+TT基因型患者。
　　3、TRIM22基因

13、RING區(qū)基因型與等位基因的頻率分布
　　慢性肝炎組與HBsAg攜帶組TRIM22基因RING區(qū)SNP位點(diǎn)-364T/C的基因型與等位基因頻率無(wú)顯著差異。慢性肝炎組-364CC基因型頻率顯著高于自限感染組，慢性肝炎組-364C等位基因頻率顯著高于自限感染組。
　　4、TRIM22基因RING區(qū)SNP與HBV感染結(jié)局相關(guān)性的Logistic回歸分析
　　以自限性HBV感染者為對(duì)照組對(duì)影響乙肝慢性化的宿主遺傳因素進(jìn)行多因素

14、Logistic回歸分析，調(diào)整掉年齡、性別、吸煙、飲酒因素的影響后，-364T/C位點(diǎn)CC基因型是HBV感染慢性化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　三、妊娠期鋅缺乏對(duì)仔鼠體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響
　　1、妊娠期鋅缺乏抑制免疫細(xì)胞向脾臟聚集
　　接種乙肝疫苗后對(duì)照組仔鼠脾細(xì)胞數(shù)顯著增多，而ZD組和ZS組脾細(xì)胞數(shù)量與未接種疫苗的仔鼠相比無(wú)顯著差異。
　　2、妊娠期鋅缺乏對(duì)小鼠脾臟T細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響
　　與對(duì)

15、照組相比，ZD組仔鼠脾T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量顯著降低，但T細(xì)胞在全脾細(xì)胞中比例卻升高，ZD仔鼠脾的CD4+T細(xì)胞在脾T細(xì)胞中的比例顯著降低，而CD8+T細(xì)胞的比例卻有明顯的升高，CD4+/CD8+比值降低。
　　3組仔鼠脾細(xì)胞經(jīng)rHBsAg刺激72 h后，ZD和ZS組均未發(fā)生明顯的增殖。
　　3、妊娠期鋅缺乏對(duì)小鼠脾臟B細(xì)胞數(shù)量和體液免疫應(yīng)答的影響
　　與對(duì)照組相比，ZD組仔鼠脾CD19+B細(xì)胞不僅絕對(duì)數(shù)量顯著降低，而且在全

16、脾細(xì)胞中的比例也顯著降低。ZS組仔鼠的妊娠晚期補(bǔ)鋅治療對(duì)B細(xì)胞數(shù)量及在全脾細(xì)胞中的比例并無(wú)改善作用。
　　ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZD組仔鼠的總IgG水平以及IgG2a和IgG1水平均顯著低于對(duì)照組，并且IgG2a/IgG1比值也顯著降低。
　　四、妊娠期鋅缺乏影響仔鼠體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制
　　1、妊娠期鋅缺乏對(duì)Th1和Th2類(lèi)細(xì)胞因子釋放的影響
　　ELISA法對(duì)3組仔鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4的水

17、平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與ZD和ZS組仔鼠脾細(xì)胞分泌的IFN-γ顯著降低，而3組間IL-4水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、妊娠期鋅缺乏對(duì)脾CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-4表達(dá)的影響
　　3組仔鼠脾細(xì)胞懸液經(jīng)rHBsAg刺激72 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZD組仔鼠HBsAg特異性CD4+T細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)的水平最低，ZS組仔鼠與ZD組相比并無(wú)顯著差異。3組動(dòng)物IL-4表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、妊娠期鋅缺乏對(duì)脾CD8+T細(xì)

18、胞IFN-γ表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組比較后發(fā)現(xiàn)，ZD組仔鼠表達(dá)IFN-γ的HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞明顯減少，而ZS組仔鼠與ZD組相比并無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.遼寧省漢族HBV感染者TRIM22蛋白R(shí)ING區(qū)及SPRY區(qū)編碼基因SNP主要發(fā)生在-364T/C位點(diǎn)。
　　2.TRIM22蛋白R(shí)ING區(qū)編碼基因-364T/C位點(diǎn)SNP與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)， CC基因型是HBV感染慢性化獨(dú)立危險(xiǎn)因素。