PD-1-PD-L1通路在HBV感染中作用的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：HBV感染者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)與疾病狀態(tài)的關(guān)系
　　 目的：程序性死亡受體-1(PD-1)是一個(gè)主要介導(dǎo)細(xì)胞間負(fù)性信號(hào)通路的，大部分表達(dá)于活化T細(xì)胞表面的跨膜單體蛋白。本研究探討健康對(duì)照，慢性乙型肝炎和重型乙型肝炎患者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平和HBV特異性CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTLs）數(shù)量，分析PD-1 通路與不同HBV感染疾

2、病狀態(tài)的關(guān)系。
　　 方法：流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)健康對(duì)照，慢性乙型肝炎和重型乙型肝炎患者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平；HLA2-抗原肽五聚體結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)健康對(duì)照，慢性乙型肝炎和重型乙型肝炎患者外周血HBV特異性CD8+CTLs數(shù)量，Real-time PCR法檢測(cè)患者血清中的HBV DNA含量。
　　 結(jié)果：慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率（13.86%±3.38

3、%）明顯高于健康對(duì)照（4.63%±0.73%，P<0.01)和重型乙型肝炎患者（6.80%±2.19%，P<0.01）；與重型乙型肝炎患者相比（0.81%±1.23%），慢性乙型肝炎患者外周血HBV特異性CD8+CTLs 占CD8+T 淋巴細(xì)胞百分率較少(0.37%±0.43%，P<0.05)。患者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平與HBV特異性CD8+CTLs數(shù)量成負(fù)相關(guān)而與血清HBV DNA 載量呈明顯正相關(guān)（P<0.

4、05），與ALT 水平則無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：HBV感染患者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平與患者HBV特異性CTLs數(shù)量成負(fù)相關(guān)，與血清HBV-DNA 載量成正相關(guān)，與ALT 水平則無(wú)明顯相關(guān)性。重型乙型肝炎患者外周血HBV特異性CD8+CTLs 反應(yīng)比慢性乙型肝炎患者強(qiáng)烈。
　　 第二部分：慢性乙型肝炎病毒感染小鼠模型的建立
　　 目的：建立具有免疫活性的慢性HBV感染小

5、鼠模型方法：以水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)將溶于小鼠體重8%PBS的具有復(fù)制能力的10 μg HBV質(zhì)粒pAAV/HBV1.2通過(guò)尾靜脈5秒內(nèi)高壓注射入C57BL/6小鼠體內(nèi)。注射后第1、30、90天用Real-time PCR法檢測(cè)小鼠血清中的HBV-DNA水平，注射后第1、14天用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中HBsAg和HBeAg，28天檢測(cè)抗-HBs和抗-HBc。第105天用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織中的HBsAg，HE染色法檢測(cè)肝組織的病理學(xué)特征

6、，Real-time PCR法檢測(cè)肝和腎組織中的HBV DNA含量。
　　 結(jié)果：60只小鼠注射pAAV/HBV1.2后，有22只小鼠在注射后第1和第14天血清中可檢測(cè)到HBsAg和HBeAg，其余小鼠血清中始終未檢測(cè)到HBsAg和HBeAg。小鼠血清中HBV DNA在注射后第1天平均為5.02×103copies/mL，然后第30天血清HBV DNA和HBeAg在HBsAg陰性小鼠體內(nèi)檢測(cè)不到，但在HBsAg陽(yáng)性小鼠體內(nèi)血清病

7、毒平均水平為4.48×104copies/mL，第90天為4.82×104copies/mL。盡管模型小鼠產(chǎn)生了抗-HBc，均未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生針對(duì)HBV的保護(hù)性抗體即抗-HBs。第90天檢測(cè)模型小鼠血清ALT 平均水平為130U/L（正常小鼠ALT活力均值范圍為16～42U/L）。HE染色發(fā)現(xiàn)模型小鼠的肝臟有中等程度的炎癥反應(yīng)。免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)模型小鼠肝細(xì)胞漿中HBsAg為陽(yáng)性。Real-time PCR法檢測(cè)到模型小鼠肝和腎組織中有HBV

8、 DNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：模型小鼠血清和肝腎組織的HBsAg、HBeAg及HBV DNA陽(yáng)性結(jié)果，HE染色和血清ALT水平顯示模型小鼠的肝臟有中等程度的炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果均表明慢性HBV感染小鼠模型建立成功。
　　 第三部分：體內(nèi)阻斷PD-1/PD-L1通路對(duì)慢性HBV感染小鼠體內(nèi)病毒及生化水平的影響
　　 目的：探討抗PD-L1單克隆抗體在慢性HBV感染小鼠模型體內(nèi)抗HBV的效果。
　　 方法：建立慢

9、性HBV感染小鼠模型后第90天用Real-timePCR法檢測(cè)血清中HBVDNA 水平。根據(jù)HBV DNA 水平將18只小鼠配對(duì)，分成抗PD-L1單克隆抗體、IgG2a同型對(duì)照抗體對(duì)照組和PBS對(duì)照組（每組6只）。于造模后第91天進(jìn)行PD-1/PD-L1體內(nèi)阻斷實(shí)驗(yàn)：抗PD-L1單克隆抗體阻斷組給予含200 μg 抗PD-L1單克隆抗體的200 μlPBS（IgG2a同型對(duì)照抗體對(duì)照組給予含200 μg IgG2a同型對(duì)照抗體的200

10、μl PBS，PBS組給予200 μl PBS）腹腔注射，隔日一次，一共2次。于注射前1天、注射后第7、14天，Real-time PCR法檢測(cè)小鼠血清中HBV DNA水平，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清中ALT水平。阻斷后第14天Real-time PCR法檢測(cè)小鼠肝和腎組織中的HBV DNA含量。HE染色分析肝組織病理變化，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織HBsAg表達(dá)情況，并分析模型小鼠和健康對(duì)照小鼠肝臟內(nèi)PD-L1的表達(dá)。
　　

11、結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)模型小鼠肝細(xì)胞表達(dá)PD-L1的水平顯著高于健康對(duì)照小鼠（P<0.05）。與腹腔注射含IgG2a同型對(duì)照抗體的PBS組和單純PBS組相比，抗PD-L1單克隆抗體組的肝組織病理學(xué)顯示肝炎炎癥活動(dòng)度升高，同型對(duì)照抗體+PBS組和單純PBS組肝組織病理學(xué)沒(méi)有明顯改變?？筆D-L1單克隆抗體組ALT平均水平由阻斷前1天的130U/L升高到阻斷后第7天的580U/L，阻斷后第14天為558U/L。接受抗PD-L1單克隆抗體注射的小鼠血

12、清HBV DNA 載量較同型對(duì)照抗體或單獨(dú)PBS注射小鼠顯著降低（P<0.05），并且阻斷后其病毒載量仍然持續(xù)降低。抗PD-L1單克隆抗體也能抑制小鼠肝和腎組織中HBsAg和HBV-DNA的表達(dá)（P<0.05）。各組小鼠保持健康，并未顯示出其它任何疾病的表現(xiàn)。
　　 結(jié)論：慢性HBV感染小鼠模型肝內(nèi)表達(dá)PD-L1水平較健康對(duì)照小鼠顯著升高，體內(nèi)阻斷PD-1/PD-L1通路能有效提高小鼠自身抗病毒功能，從而明顯降低小鼠血清，肝和腎