16SrRNA通用引物在血小板污染檢測中的應用.pdf

1、目的：血小板需要在(20±2)℃的有氧條件下保存(保存期為5天)，這樣的條件有利于細菌的生長。輸注細菌污染的血小板會引起嚴重的敗血癥，嚴重的有可能導致患者死亡。減少這種敗血癥的發(fā)生是目前輸血領域十分關注的問題。目前，許多輸血前細菌污染的檢測方法已經被血液中心采用，以減少輸血相關的敗血癥的發(fā)生。血液全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)目前被認為是檢測血小板細菌污染的金標準。這種方法目前已經被大多數的血液中心采用，來檢測血小板中的細菌污染。這種方法用于檢測血

2、小板中污染的細菌是有效的，但同時也有不足。主要是由于其需要的檢測時間較長。因此需要有一種更有效的方法來檢測血小板中的細菌污染。這種方法應簡單、足夠靈敏并且可以檢測到所有有臨床意義的細菌。還要有高度的特異性，并且快速，在數小時內完成，允許在血小板發(fā)送到臨床前或輸注給患者前得出準確的結果。有文獻報道，以16SrRNA基因為模板，設計合成細菌的通用引物，可以檢測各種細菌，并且具有靈敏度高，快速準確的特點。本文將此方法加以改進，用于血小板污染菌

3、的檢測并與全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)(BacT/AL,ERT，bioMérieux)相對比。 方法：收集保存24小時和48小時的血小板標本。提取血小板中的細菌DNA并進行PCR擴增。PCR擴增使用針對細菌的16SrDNA基因設計通用引物。為了更好的鑒定細菌的種類，同時引入細菌的16S～23SrRNA區(qū)問引物。PCR產物用限制性內切酶HaeⅢ消化30分鐘。酶切產物稀釋20倍，用ABI PRISM 310檢測酶切產物的多態(tài)性。同時，用Bac

4、T/ALERT全自動培養(yǎng)系統(tǒng)檢測同一份血小板中是否有細菌污染。用無菌三蒸水1：10<'n>系列稀釋大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，取各稀釋度樣本1ml于Ep管中，使用本實驗方法，以能檢測到細菌的最低濃度為本方法的靈敏度。加入Sau3A I(1U/PCR)，以去除Taq酶中可能存在的污染DNA，保證本實驗方法的靈敏度。 結果：本實驗共收集了保存期的血小板標本276份，其中保存24小時的血小板標本為144份，保存48小時的血

5、小板標本為132份。檢測到2份樣本(占0.7246﹪)有細菌污染，污染的細菌分別為金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。使用全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)(BacT/ALERT，bioMérieux)檢測到陽性信號的時間分別為20.8和58.5小時左右。我們還從一份臨床返回的有輸血反應的標本中檢測到了表皮葡萄球菌。使用全自動培養(yǎng)系統(tǒng)(BacT/ALERT，bioMérieux)檢測到陽性信號的時間大約為35.6小時。用系列稀釋的方法得出本方法的檢測靈敏度為