植物ADH基因家族的生物信息學(xué)分析及棉花Zn結(jié)合脫氫酶的克隆與原核表達(dá).pdf

1、在本研究中，我們用生物信息學(xué)的方法分析了玉米等物種ADH的保守功能域、蛋白二級結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系。分析證實，植物ADH通常含有3個保守功能域，它們是具有GroES結(jié)構(gòu)的ADH-N結(jié)構(gòu)域，Rossmann折疊NAD(P)(+)結(jié)合蛋白和鋅結(jié)合位點，這3個保守結(jié)構(gòu)在各個物種中具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。二級結(jié)構(gòu)的分析表明，在我們研究的物種中，每個物種的兩個ADH同工酶折疊情況大體相同，物種間蛋白二級結(jié)構(gòu)也趨向一致。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析了供試物種中AD

2、H以及ADH兩個同工酶間的進(jìn)化關(guān)系。初步顯示，在進(jìn)化上，單、雙子葉植物源自不同的ADH祖先。雙子葉植物ADH在物種間具有差異；而在單子葉植物不同物種其ADH同工酶出現(xiàn)分化。
　　我們對一個百脈根的匿名序列（序列編號為CAG30579.1）進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測、二級結(jié)構(gòu)以及進(jìn)化關(guān)系分析，初步推定該匿名序列為百脈根乙醇脫氫酶基因的未知同源基因LcADH(t)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測LcADH(t)含有ADH_N、NADB_Rossmann和鋅

3、結(jié)合位點這3個典型的ADH結(jié)構(gòu)域。LcADH(t)的二級結(jié)構(gòu)顯示出與其他ADH極高的相似性，尤其體現(xiàn)在3個保守結(jié)構(gòu)區(qū)。同時，在核苷酸和氨基酸序列上，與LcADH1又存在著一定的差別，這意味著LcADH(t)與LcADH1并非同一基因，且這種差別也非同一基因的種間差別。從進(jìn)化關(guān)系分析上可知LcADH(t)與LcADH1之間在同一類的兩個不同分支，據(jù)此，我們推斷，LcADH(t)可能發(fā)揮著LcADH2的功能，值得期待進(jìn)一步的功能驗證。

4、>　　我們通過對陸地棉的一個409bp的cDNA片段進(jìn)行解析，insilico拼接出一條完整的開放閱讀框（Open Reading Frame,ORF）。我們推定這條ORF在陸地棉中真實存在，并在閱讀框的兩端設(shè)計了擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增正向引物為：5—CACCACTAGATCACAAGAATAATAATGG—3，反向引物為：5—AAAAGGAGAAGCAATTTACATTATCTC—3。以陸地棉總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行P

5、CR擴(kuò)增，獲得全長基因序列。ORF分析表明，序列中包含一個1305bp的ORF，編碼434個氨基酸。通過BLAST和多重序列比對，我們克隆的序列可能是一個鋅結(jié)合脫氫酶家族蛋白的同源蛋白，將其命名為棉花鋅結(jié)合脫氫酶蛋白（cotton zinc-binding dehydrogenase family protein），將該基因命名為GhZBDH。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，從氨基酸鏈的63位至433位，是進(jìn)行能量制造與轉(zhuǎn)化的第三類鋅結(jié)合乙醇脫氫酶

6、AdhC結(jié)構(gòu)域，87至221位是ADH_N結(jié)構(gòu)域，269至394位是NAD（P）結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域預(yù)測的結(jié)果進(jìn)一步暗示，這個蛋白質(zhì)在一級結(jié)構(gòu)上具有與其他物種ADH類似的構(gòu)成狀況，可能發(fā)揮著ADH功能。
　　我們成功的將棉花鋅結(jié)合脫氫酶基因構(gòu)建到PQE-30載體之中，重組載體命名為pQE30-GhV3。然后應(yīng)用熱激轉(zhuǎn)化法將pQE30-GhV3重組載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株M15中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)研究證明，這個蛋白表達(dá)的最適合溫度為3