條件性剔除CD11c+細(xì)胞減輕小鼠心肌缺血-再灌注損傷及其機(jī)制.pdf

1、背景：
　　冠狀動(dòng)脈心臟病及其引發(fā)的急性心肌梗死（acutemyocardialinfarction,AMI）是目前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的“頭號(hào)殺手”。藥物溶栓或介入治療雖然能使心肌梗死患者的阻塞冠脈及時(shí)再通，挽救缺血心肌，改善心臟功能，但再灌注本身亦能造成心肌損傷，即再灌注心肌損傷。臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證據(jù)均表明，以炎癥因子表達(dá)與釋放、炎性細(xì)胞趨化與浸潤(rùn)為特征的炎癥反應(yīng)是造成心肌缺血/再灌注（myocardialischemia/r

2、eperfusion,MI/R）損傷的重要機(jī)制之一。心肌梗死后趨化、浸潤(rùn)至缺血區(qū)心肌組織的巨噬細(xì)胞能釋放多種促炎細(xì)胞因子、趨化因子等，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大，從而損傷血管內(nèi)皮和心肌細(xì)胞，破壞細(xì)胞外基質(zhì)，引起心肌間質(zhì)纖維化及病理性心室重塑；同時(shí)，巨噬細(xì)胞能夠吞噬清除壞死細(xì)胞和組織碎片，促進(jìn)膠原合成、血管發(fā)生、細(xì)胞外基質(zhì)重建，對(duì)于心肌梗死后受損組織的修復(fù)愈合至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞在心肌梗死后炎癥反應(yīng)中的功能多樣性可能與巨噬細(xì)胞亞群的異質(zhì)性（

3、heterogeneity）有關(guān)。研究表明促炎癥性巨噬細(xì)胞（M1）具有吞噬、促炎、水解作用，能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，降解細(xì)胞外基質(zhì)；抗炎性巨噬細(xì)胞（M2）能抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管發(fā)生和組織修復(fù)。此外，心肌梗死后樹(shù)突狀細(xì)胞（dendriticcells,DCs）浸潤(rùn)至梗死區(qū)周?chē)M織并參與活化T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答；由固有免疫信號(hào)途徑募集、活化的DCs還參與心肌梗死后病理性心室重塑。由此可見(jiàn)，心肌梗死后或MI/R時(shí)趨化浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，既促進(jìn)

4、炎癥反應(yīng)、造成組織損傷，又參與炎癥解決、缺血心肌損傷修復(fù)，發(fā)揮“雙刃劍”的作用；若能特異性地抑制MI/R后促炎性巨噬細(xì)胞的有害作用，同時(shí)保留能夠抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)愈合的巨噬細(xì)胞亞群，則能減輕MI/R損傷。本研究擬采用條件性剔除CD11c+細(xì)胞的CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠，探討如下科學(xué)假說(shuō)：選擇性地干預(yù)（剔除）促炎性M1巨噬細(xì)胞（CD11c+F4/80+）和CD11c+DCs，是否能抑制MI/R后過(guò)度的炎癥反應(yīng)，從而減輕MI/R

5、損傷？
　　目的：
　　1.明確促炎性CD11c+細(xì)胞和CD11c+F4/80+M1型巨噬細(xì)胞在MI/R損傷中的作用；
　　2.探討條件性剔除CD11c+細(xì)胞和CD11c+F4/80+M1型巨噬細(xì)胞能否減輕MI/R損傷及其主要機(jī)制。
　　方法：
　　1.在MI/R手術(shù)前12h，給予CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射白喉毒素（DT）（4ng/gbodyweight），將其體內(nèi)CD11c+細(xì)胞條件性、選擇性剔

6、除。通過(guò)觀(guān)察脾臟CD11c分子表達(dá)情況證實(shí)特異性剔除的效果。
　　2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分四組：①C57BL/6J小鼠假手術(shù)組（WT-Sham）；②C57BL/6J小鼠手術(shù)組（WT-MI/R）；③CD11c-DTR小鼠假手術(shù)組（DTR-Sham）；④CD11c-DTR小鼠手術(shù)組（DTR-MI/R）。用8/0單絲丙綸縫線(xiàn)在左心耳下緣2mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，PE套管阻斷冠脈血流，缺血30min后松開(kāi)PE套管，使缺血心肌再灌注24h或48h

7、。假手術(shù)組不阻斷冠脈血流，其余操作同手術(shù)組。
　　3.再灌注48h后，取出心臟并行OCT包埋、冰凍切片。用免疫熒光染色法檢測(cè)梗死區(qū)及周?chē)募〗M織CD11c+細(xì)胞的浸潤(rùn)，以及TNF-α表達(dá)情況。
　　4.再灌注48h后，取出心臟并分離得到全心單細(xì)胞懸液，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測(cè)定浸潤(rùn)至再灌注心臟的CD11c+細(xì)胞及CD11c+F4/80+巨噬細(xì)胞占全心單細(xì)胞懸液百分比。
　　5.采用Millar壓力-容量探測(cè)系統(tǒng)，將微

8、探頭經(jīng)頸總動(dòng)脈插入左心室，測(cè)定左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），左心室舒張末壓（LVEDP）以及左室內(nèi)壓最大變化速率（±dP/dtmax）等心功能指標(biāo)。
　　6.通過(guò)TTC染色顯示梗死心肌組織，稱(chēng)量并計(jì)算梗死區(qū)組織重量占左心室重量百分比，反映心肌梗死范圍。
　　7.采用TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，用Westernblot方法測(cè)定缺血區(qū)心肌組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和γ干擾素（IFN-γ）的表達(dá)，以及硝基酪氨酸（Ni

9、trotyrosine）水平（蛋白質(zhì)硝基化指標(biāo)）。
　　結(jié)果：
　　1.腹腔注射DT（4ng/gbw）能有效剔除CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)CD11c+細(xì)胞。免疫熒光染色顯示CD11c-DTR小鼠脾臟，尤其是淋巴小結(jié)周?chē)鷧^(qū)CD11c表達(dá)顯著減少。
　　2.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，WT組MI/R（30min/48h）后，有大量CD11c+細(xì)胞浸潤(rùn)至缺血區(qū)心肌，而CD11c-DTR小鼠MI/R后，CD11c+細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少

10、。此外，在WT-MI/R組還觀(guān)察到CD11c+細(xì)胞在冠狀動(dòng)脈血管壁的浸潤(rùn)。FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD11c-DTR小鼠MI/R后，浸潤(rùn)至再灌注心臟的CD11c+細(xì)胞及CD11c+F4/80+巨噬細(xì)胞占全心單細(xì)胞懸液的百分比顯著降低（分別是6.55±0.44％，與WT-MI/R組10.79±0.91％相比，P<0.05；3.48±0.43％，與WT-MI/R組6.54±0.63％相比，P<0.05；n=3-5）。
　　3.CD11c+細(xì)胞

11、缺失的CD11c-DTR小鼠MI/R（30min/24h-48h）后，心肌細(xì)胞凋亡減少；心肌梗死組織重量占左心室重量百分比降低（9.6±1.87％,與WT-MI/R組14.9±1.63％相比，P<0.05，n=6）。
　　4.WT組MI/R（30min/48h）后心臟功能明顯受損，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEF下降，LVEDP升高，±dP/dtmax減小；而CD11c-DTR小鼠MI/R后其LVEF得到改善，LVEDP降低。
　　5.CD1

12、1c+細(xì)胞缺失的CD11c-DTR小鼠MI/R（30min/48h）后，缺血區(qū)心肌組織炎性細(xì)胞因子TNF-α,MCP-1和IFN-γ的表達(dá)顯著減少（與WT-MI/R組相比,P均<0.05，n=6-8）；反映蛋白質(zhì)硝基化的Nitrotyrosin水平也降低（與WT-MI/R組相比,P均<0.05，n=6-8）。
　　結(jié)論：
　　心肌缺血/再灌注后，促炎性CD11c+細(xì)胞和CD11c+F4/80+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至再灌注心肌，并參與