菊粉內(nèi)切酶基因克隆、表達(dá)及菊寡糖中試設(shè)計.pdf

1、菊粉是一種天然果聚糖，菊粉內(nèi)切酶能夠水解菊粉生成低聚果糖，低聚果糖是一種功能性食品添加劑，其保健作用體現(xiàn)在能夠降低血糖水平，促進(jìn)人體和動物腸道的微生態(tài)平衡和提高免疫力等等。利用微生物菊粉內(nèi)切酶可以一步法水解菊粉獲得高達(dá)80％的低聚果糖，但是只有少數(shù)微生物產(chǎn)菊粉內(nèi)切酶，并且產(chǎn)酶量極低，從而造成分離純化困難，制約低聚果糖工業(yè)的發(fā)展。本研究的主要目的就是構(gòu)建菊粉內(nèi)切酶的工程酵母來高效表達(dá)菊粉內(nèi)切酶，為解決目前低聚果糖生產(chǎn)中的問題提供有效的解決

2、途徑。 本研究以黑曲霉9891的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得了編碼菊粉內(nèi)切酶的基因，并將它克隆進(jìn)表達(dá)載體pPIC9，經(jīng)過酶切、PCR和測序驗證后，將重組表達(dá)載體pPIC9-Endoinu經(jīng)BglⅡ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化到PichiapastorisGS115中。重組子通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。重組菊粉內(nèi)切酶在PichiapastorisGS115中實現(xiàn)了表達(dá)并在7L發(fā)酵罐中對其進(jìn)行了優(yōu)化表達(dá)研究，蛋白分泌量達(dá)2.15mg

3、/ml。表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析表明，蛋白質(zhì)分子量大小約為59KD。菊粉內(nèi)切酶的活性測定結(jié)果為1501U/ml(以蔗糖為底物)和291U/ml(以菊粉為底物)，同原始供體菌株相比，分別高105倍和273倍，通過酶學(xué)特性研究顯示該酶反應(yīng)最適pH為5.6，最適溫度是55℃。同時還對菊粉內(nèi)切酶的高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，得到了該蛋白的高級結(jié)構(gòu)的初步信息。根據(jù)SDS-PAGE電泳和酶的功能性分析，證明目的蛋白已在Pichiapastoris中成