眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素（CTX-b）的分離純化、抗腫瘤作用及機(jī)制的研究.pdf

1、[背景與目的] 眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素(CTXs)來源豐富，抗腫瘤作用強(qiáng)，長期以來受到關(guān)注，但作用機(jī)制仍不清楚。較長一段時間認(rèn)為CTXs與細(xì)胞膜結(jié)合，依賴其特征性的空間結(jié)構(gòu)一“三指”插入細(xì)胞膜中形成孔道，可能影響細(xì)胞內(nèi)外離子的平衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂。最近由不同研究室的學(xué)者在激光共聚焦顯微鏡下分別觀察到，CTX在數(shù)分鐘內(nèi)進(jìn)入線粒體并破壞線粒體結(jié)構(gòu)，以及眼鏡蛇毒CTX輕易進(jìn)入活的腫瘤細(xì)胞內(nèi)并濃集于溶酶體，其含量與CTX的細(xì)胞毒作用密

2、切相關(guān)。由此提示CTXs影響線粒體及溶酶體等胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的功能可能是其主要抗癌機(jī)制，對細(xì)胞膜的溶解作用可能是其下游作用。 目前認(rèn)為線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控的中心環(huán)節(jié)之一。線粒體感受多種刺激發(fā)生線粒體滲透性轉(zhuǎn)變孔(MPTP)開放，釋放膜間隙中的促凋亡蛋白細(xì)胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子AIF等。釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素c在dATP存在的條件下能與凋亡蛋白酶激活因子．1(Apaf-1)結(jié)合，從而召集caspase-9形成凋亡體(apoptosome

3、)，被激活的caspase-9能激活下游的凋亡效應(yīng)分子caspase-3，經(jīng)蛋白水解級聯(lián)作用引起細(xì)胞凋亡。 CTXs在數(shù)分鐘內(nèi)即進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與線粒體結(jié)合，那么對線粒體通路有何影響?本研究從眼鏡蛇毒中分離純化不含PLA2的CTX-b，測定其體內(nèi)外抗腫瘤作用，觀察CTX-b對NB4細(xì)胞的致凋亡作用，著重研究CTX-b對NB4細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm)、cytochromec的釋放、caspase-9及caspase-3的活性變化的影響

4、，從線粒體信號途徑入手，探討CTX-b的胞內(nèi)作用機(jī)制。 [主要實(shí)驗(yàn)方法] lCTX-b的分離提純 應(yīng)用Sephadex-G50凝膠過濾、CM-Sepharose陽離子交換層析及Se曲acrylS-200HighResolutin預(yù)裝柱分離純化。 2CTX-b的抗腫瘤活性 2．1MTT法測定體外細(xì)胞毒作用 2．2對U14荷瘤小鼠瘤質(zhì)量的影響 2．3形態(tài)學(xué)觀察：熒光顯微鏡，電鏡

5、 2．4流式細(xì)胞儀DNA含量分析 3CTX-b對線粒體功能的影響 3．1流式細(xì)胞儀測線粒體膜電位 3．2Western-blot測定胞漿cytoc~omec及caspase9、caspase3的變化 [結(jié)果] 一、眼鏡蛇粗毒經(jīng)SephadexG-50柱層析得到4個峰，經(jīng)小鼠毒性測定及分子量判斷，第3峰含CTX。濃縮第3峰上CM-Sepharose陽離子交換柱，得到Ⅵ個組分，其中組分Ⅵ經(jīng)鑒定為CTX

6、組分。將組分Ⅵ上SephacrylS-200HR預(yù)裝柱精細(xì)純化，獲得CTX—b，經(jīng)RP-HPLC鑒定，純度達(dá)95％以上，分子量為6．8kD，不含PLA2。 二、CTX-b對NB4、HL-60、SGC-7901細(xì)胞6h的IC50分別為1．8、1．78、2．07[tg／ml；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，CTX-b0．75及1．0mg／kg／day腹腔給藥，對荷U14瘤小鼠的抑瘤率分別為22．5％及46．3％，具有顯著性差異。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示了CTX

7、-b強(qiáng)有效的抗腫瘤作用。 三、首次研究CTX對人早幼粒白血病細(xì)胞一NB4細(xì)胞的促凋亡作用。熒光顯微鏡、電鏡下觀察到，CTX-b(1．O~tg／m1)作用于NB4細(xì)胞3h，即出現(xiàn)典型凋亡改變：染色體凝集，核碎裂，凋亡小體形成等。流式細(xì)胞儀DNA含量分析，作用3h，1．0gg／ml及1．5~tg／mlCTX-b出現(xiàn)明顯的亞Gl期凋亡峰；作用6h，三組劑量(CTX-b0．5[tg／ml、1．Ogg／ml、1．5~tg／m1)均出現(xiàn)亞G

8、l期凋亡峰，并與劑量成正相關(guān)?？梢?，致凋亡是CTX-b對NB4細(xì)胞的早期主要作用，且CTX-b對NB4細(xì)胞的致凋亡作用具有劑量依賴及時間依賴關(guān)系。 四、首次證實(shí)CTX-b對NB4細(xì)胞線粒體信號通路的影響：CTX-b(1．Ogg／m1)作用0．5h，線粒體膜電位(△Ψm)已開始下降，在胞漿提取物中檢測到cyt∞hromec，顯示cytochromec已由線粒體釋放入胞漿，且△Ψm的下降與cyt∞hromec的釋放兩者變化趨勢相符。

9、Westernblot結(jié)果顯示，caspase9酶原的含量在CTX-b(1．O!ag／m1)·作用1h時開始下降，而活化的caspase3片斷(17kD)在0．5h即檢測到，表明除了通過caspase9，CTX-b還可能通過其它途徑激活caspase3。 五、為進(jìn)一步證實(shí)CTX-b通過caspase途徑誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，利用caspase-9抑制劑--z-LEHD-fmk及caspase-3抑制劑--z-DEVD-fmk，發(fā)現(xiàn)

10、z-LEHD-fmk(1Op．mol／L)及z-DEVD-fmk(1O~tmol／L)對CTX-b(1．0gg／m1)誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡均有抑制作用，其中caspase-3抑制劑--z-DEVD-fmk的抑制作用更明顯。 [結(jié)論] 一、從眼鏡蛇粗毒中分離獲得CTX純品——CTX-b，分子量為6．8kD，不含PLA2，有利于正確評價CTX-b的抗腫瘤作用。 二、CTX-b對體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞均有明顯的細(xì)胞毒作用。對N

11、B4細(xì)胞6h的IC50分別為1．Sgg／ml，與ShuH．S．17等報(bào)道的Cardiotoxin-III(從臺灣眼鏡蛇毒中分離獲得的CTX)誘導(dǎo)經(jīng)PHA刺激的人CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡所需劑量10μg/ml相比，CTX-b殺傷腫瘤細(xì)胞所需劑量小得多；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，CTX-b0．75及1．0mg／kg／day腹腔給藥，對荷U14瘤小鼠的抑瘤率分別為22．5％及46．3％，具有顯著性差異，表明CTX-b對在體腫瘤同樣具有明顯的抑制作用。體內(nèi)外實(shí)

12、驗(yàn)均顯示了CTX-b在抗腫瘤方面的應(yīng)用價值。 三、首次研究CTX-b對人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞一NB4細(xì)胞的促凋亡作用。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀DNA含量分析，顯示致凋亡是CTX-b對NB4細(xì)胞的早期主要作用，且CTX-b對NB4細(xì)胞的致凋亡作用具有劑量依賴及時間依賴關(guān)系。 四、首次證實(shí)CTX-b對NB4細(xì)胞線粒體信號通路的影響。CTX-b可通過降低線粒體△Ψm、cytochromec釋放一一caspase-9被激活一一激