版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、目的:制作細粒棘球蚴BALB/e鼠模型,從細粒棘球絳蟲原頭節(jié)擴增Eg95蛋白編碼基因,克隆入大腸桿菌.分枝桿菌穿梭載體pBCG,電穿孔轉化BCG,構建細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗,探討Eg95抗原在重組BCG中的表達效率;用該疫苗免疫BALB/c小鼠,動態(tài)觀察免疫小鼠血清IgE、IgG及其亞類的變化規(guī)律;脾T細胞CD4+和CD8+亞群變化,以及脾細胞培養(yǎng)上清液IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α變化水平;通過不同的免疫途徑
2、接種疫苗,在原頭節(jié)攻擊后,觀察實驗動物產生的保護力和檢測血清IgE、IgG及其亞類;脾T細胞CD4+和CD8+亞群變化,脾細胞培養(yǎng)上清液IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α水平,以及脾細胞的凋亡,從而初步闡述其保護性免疫機制,為CE疫苗的開發(fā)利用提供依據。 方法:以BALB/e鼠作為宿主,用腹腔注射Eg原頭節(jié)的方法制作細粒棘球蚴BALB/e模型。從Eg包囊中分離原頭節(jié),超聲粉碎后抽提總RNA作為模板。根據Genbank(A
3、F199354)基因序列,自行設計一對引物并加入內切酶位點,采用RT-PCR方法擴增Eg95編碼基因并鑒定,將該基因片段定向克隆入大腸桿菌-分枝桿菌表達載體pBCGHsp70啟動子下游,構建pBCG-Eg95重組質粒。用電穿孔法將重組質粒導入BCG菌構建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2篩選經PCR鑒定。用熱誘導方法誘導rBCG-Eg95疫苗進行表達,經SDS-PAGE和Western-blot鑒定表達的重組蛋白。 將BALB
4、/c小鼠隨機分為兩組:鼻腔粘膜接種組和口服灌胃接種組,分別用5×107CFU/mllOul和4×108CFU/ml1m1重組BCG-Eg95疫苗接種。于免疫后O、2、4、6、8、10、12、14、16和18w分別剖殺4只小鼠,收集血清,研究疫苗免疫后不同時間血清IgE、IgG及其亞類的變化規(guī)律。疫苗免疫后O、2、4、6、8、10、12、14、16和18w分別剖殺4只小鼠,分離脾細胞,應用FACSort流式細胞儀檢測T細胞CD4+和CD8
5、+亞群百分比變化。用棘球蚴囊液抗原、刀豆蛋白A或PHA刺激脾細胞培養(yǎng)后,檢測其上清液IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α變化水平。 將84只BALB/c小鼠分為7組,A組為皮下注射組,接種5×107CFU100μL;B組為鼻腔粘膜組,接種5×107CFU10μL;C組為口服灌胃組,接種4×108CFUlmL;D組為肌肉注射組,接種5×107CFUl00μL;E組為pIL-12肌肉注射組,接種50μg/mLpIL-12100
6、uL,在注射pIL-12質粒前24h,在后腿股四頭肌注射0.5%的鹽酸布比卡因50μL,然后在同一點注射pIL-12,每兩周1次,共3次;F組為BCG皮下注射組,接種5×107CFU100μL;G組為PBS皮下注射組,注射PBS100μL。疫苗免疫后10w用細粒棘球絳蟲原頭節(jié)腹腔注射感染,每只感染100個原頭節(jié)。攻擊后18w殺鼠,計算其減蚴率,檢測血清IgE、IgG及其亞類和分離脾細胞,應用FACSort流式細胞儀檢測T細胞CD4+和C
7、D8+亞群百分比,用棘球蚴囊液抗原和刀豆蛋白A或PHA刺激培養(yǎng)后,檢測其上清液IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α水平。用AnnexinV聯合PI染色法和TUNEL法檢測疫苗免疫加攻擊后鼠脾細胞凋亡。 結果:小鼠接種Eg原頭節(jié)4月后,切開腹腔發(fā)現數個大小不等的包囊,說明棘球蚴模型制作成功。經電泳及測序證實從原頭節(jié)擴增出471bpEg95蛋白編碼基因,重組質粒pBCG-Eg95經酶切及PCR證實成功連接,并經PCR鑒定成功轉
8、入BCG。在SDS-PAGE上分子量16.5kDa處見明顯表達條帶,Western-blot示重組蛋白具有抗原性,證明構建的疫苗是成功的,用Bio-RadQuantityone分析系統分析表明,在rBCG中表達效率為12%左右。 細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗免疫后小鼠IgE、IgG及其亞類的變化結果,鼻腔粘膜接種組IgG從免疫后2w開始升高,免疫后10w達最高水平,IgGl變化甚微,僅在16w時有明顯降低,IgG2a從免
9、疫后2w開始升高,免疫后6w達最高水平,隨后降低,IgG2b僅在6w時升高,IgG3從免疫后2w開始降低,免疫后12w達最低水平,IgE從免疫后2w開始降低,免疫后16w達最低水平;口服灌胃接種組IgG從免疫后4w開始升高,免疫后14w達最高水平,IgGl變化甚微,僅在8周時有明顯降低,IgG2a從免疫后6w開始升高,免疫后8w達最高水平,IgG2b從免疫后4w開始升高,免疫后8w達最高水平,IgG3從免疫后4w開始降低,免疫后10w達
10、最低水平,IgE從免疫后6w開始降低,免疫后16w達最低水平。提示該疫苗能誘導宿主產生高水平的IgG2a和IgG2b,而IgGl較低,從而提高宿主抗Eg感染的保護性免疫力。 細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗免疫小鼠后T淋巴細胞亞群變化結果,發(fā)現鼻腔粘膜接種組和口服灌胃接種組CD4+亞群百分比均從免疫后4w開始升高,免疫后10w達最高水平,且免疫后10w口服灌胃接種組CD4+亞群百分比顯著高于鼻腔粘膜接種組,提示疫苗口服灌胃接
11、種后的免疫效果優(yōu)于鼻腔粘膜接種,CD8+亞群無明顯變化。表明重組BCG-Eg95疫苗使CD4+亞群升高,促進Th1型細胞因子分泌,從而提高宿主抗細粒棘球絳蟲感染的保護力。 細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95免疫后誘導小鼠細胞因子變化結果,發(fā)現IL-2水平鼻腔粘膜接種組從免疫后2w開始升高,免疫后8~10w達最高水平;口服灌胃接種組從免疫后4w開始升高,免疫后1Ow達最高水平;IFN-γ鼻腔粘膜接種組從免疫后2w開始升高,免疫后8w
12、達最高水平;口服灌胃接種組從免疫后4w開始升高,免疫后10w達最高水平;IL-4鼻腔粘膜接種組和口服灌胃接種組僅在10w時的抗原和ConA刺激時短暫增加;TNF-α鼻腔粘膜接種組和口服灌胃接種組從免疫后2w開始升高,免疫后12w達最高水平,直到18w實驗結束一直處于較高水平,且前者較高于后者。 疫苗免疫加攻擊后發(fā)現口服灌胃組和肌肉注射組的保護力最好,減蚴率分別為88.05%和92.46%;發(fā)現IgG、IgG1、IgG2a和IgG
13、2b水平在攻擊前后都是增加的,IgG3水平幾乎沒有變化,IgE水平在攻擊前是降低的,在攻擊后是升高的;各組都誘導較高水平的IL-2、IFN-Y和TNF-α,以及低水平的IL-4,說明Thl免疫應答占優(yōu)勢。用AnnexinV染色法和TUNEL法檢測發(fā)現免疫加攻擊后小鼠脾細胞細胞凋亡明顯降低,表明疫苗可抑制感染鼠脾細胞發(fā)生凋亡,增加CD4+T細胞亞群的數量,加強宿主抗細粒棘球絳蟲感染的保護性免疫反應。 結論:從此項研究的實驗結果可得
14、出如下結論:①用RT-PCR方法,從Eg原頭節(jié)中獲得Eg95蛋白完整編碼基因。②成功構建細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗。③細粒棘球絳蟲Eg95蛋白編碼基因在BCG中穩(wěn)定表達,表達蛋白占BCG總體蛋白的12%。④rBCG-Eg95疫苗采用不同的免疫接種途徑,抗Eg原頭節(jié)攻擊的減蚴率為24.82%~92.46%,其中以口服灌胃組和肌肉注射組的保護力最好。⑤在rBCG-Eg95疫苗免疫組和免疫加攻擊組均產生高水平的IgG、IgG2a和I
15、gG2b抗體,低水平的IgGl和IgG3,IgE水平在攻擊前是降低的,在攻擊后是升高的,提示IgG、IgG2a、IgG2b和IgE可能參與保護性的免疫應答機制。⑥用rBCG-Eg95疫苗免疫BALB/c小鼠后,CD4+T細胞明顯增加,CD8+T細胞無明顯變化,Eg原頭節(jié)攻擊后不僅CD4+T細胞增加,CD8+T細胞也有輕度增加,提示疫苗的保護機制不僅有CD4+T細胞的參與,可能也有CD8+T細胞的作用。⑦在rBCG-Eg95疫苗免疫組和免
16、疫加攻擊組均產生高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α,低水平的IL-4,提示該疫苗誘導以Th1型免疫應答為主的反應,它們與免疫細胞相互作用,構成抗細粒棘球絳蟲感染的免疫調節(jié)網絡。⑧細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗可抑制感染鼠脾細胞發(fā)生凋亡,增加CD4+T細胞亞群的數量,加強宿主抗細粒棘球絳蟲感染的保護性免疫反應。⑨重組BCG疫苗具有以下優(yōu)點:表達的外源抗原不需純化,可直接用于免疫保護試驗,免去蛋白質純化的復雜工序;BCG是活菌苗
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 細粒棘球絳蟲重組Bb-Eg95-EgA31疫苗構建及其免疫機制研究.pdf
- 27511.細粒棘球絳蟲轉eg95ega31融合基因苜蓿疫苗保護力及其免疫機制研究
- 多房棘球絳蟲重組BCG-EmⅡ-3和BCG-Em14-3-3疫苗構建及其免疫機制研究.pdf
- 細粒棘球絳蟲pET30a-EgA31-Eg95重組質粒構建及鑒定.pdf
- 細粒棘球絳蟲Eg95重組非分泌型和分泌型分枝桿菌疫苗的構建及免疫學研究.pdf
- 細粒棘球絳蟲重組抗原Eg10應用價值的評價.pdf
- 細粒棘球絳蟲重組蛋白P29誘導綿羊的免疫保護力及其免疫機制研究.pdf
- 多房棘球絳蟲重組Bb-EmⅡ-3-Em14-3-3疫苗構建及其免疫機制研究.pdf
- 細粒棘球絳蟲ppt課件
- 豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗構建及其免疫學特性研究.pdf
- 曼氏迭宮絳蟲細粒棘球絳蟲
- 重組細粒棘球蚴親肌肉抗原抗小鼠感染細粒棘球蚴的免疫保護性及其機制研究.pdf
- 細粒棘球蚴Eg95表位短肽Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3的rPⅢ融合蛋白誘導小鼠免疫應答特點的研究.pdf
- 重組細粒棘球蚴親肌肉抗原抗小鼠感染細粒棘球蚴免疫保護性及其機制的研究
- 霍亂毒素B亞單位與細粒棘球絳蟲EG95融合疫苗候選抗原蛋白的克隆與表達及其葉綠體表達載體的構建與轉化.pdf
- 細粒棘球絳蟲微小膜殼絳蟲ppt課件
- 細粒棘球蚴重組抗原Eg10和mMDH致樹突狀細胞免疫耐受的機制研究.pdf
- CpG佐劑對羊細粒棘球蚴Eg95抗原的免疫增強作用研究.pdf
- 綿羊CTLA-4胞外區(qū)對細粒棘球蚴EG95抗原的免疫佐劑作用.pdf
- 細粒棘球絳蟲成蟲全長cdna質粒文庫的構建及鑒定
評論
0/150
提交評論