華支睪吸蟲診斷抗原基因的篩選、克隆和生物信息學(xué)分析.pdf

1、[目的]
　　 用陽(yáng)性血清篩選華支睪吸蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫(kù),以其篩選到新的序列,研究其功能,希望成為新的診斷抗原基因?yàn)槿A支睪吸蟲的診斷制劑的研發(fā)、抗華支睪吸蟲病藥物的新靶藥點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)甚至為候選疫苗的研制提供重要的研究基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)的免疫學(xué)篩選:
　　 免疫篩選血清的收集;抗血清預(yù)吸收;宿主菌的制備;cDNA文庫(kù)的免疫學(xué)篩選;定位并挑取其中的2個(gè)陽(yáng)性克隆。

2、>　　 2.2個(gè)新序列的擴(kuò)增、測(cè)序和克隆:
　　 2個(gè)陽(yáng)性克隆PCR鑒定;PCR產(chǎn)物的純化回收;純化的DNA片段與克隆載體連接并轉(zhuǎn)化;質(zhì)粒的提取和雙酶切;測(cè)序;設(shè)計(jì)引物、2個(gè)新序列的PCR、克隆與質(zhì)粒的提取、酶切;新基因序列的片段與表達(dá)載體的連接和轉(zhuǎn)化。
　　 3.對(duì)篩選到的新序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析:
　　 使用DNA star軟件中的Editseq程序進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析,包括開放閱讀框、氨基酸組成、蛋白質(zhì)相對(duì)

3、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)等;使用在線HNN軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析,包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲等;使用Expasy軟件對(duì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和跨膜螺旋的預(yù)測(cè);使用BLASTx程序進(jìn)行基因的比對(duì)和同源性分析;使用Expasy軟件中的NetPhos程序進(jìn)行特定位點(diǎn)分析;使用SignaIP軟件進(jìn)行信號(hào)肽序列分析;使用IEDB AnalysisRecource在線分析工具進(jìn)行抗原表位和親水性分析;使用rpsblast對(duì)結(jié)構(gòu)域分析等等。
　　 [結(jié)果

4、]
　　 對(duì)華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選,篩選到了12個(gè)陽(yáng)性克隆,對(duì)其中的2個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了亞克隆,預(yù)測(cè)了其片段長(zhǎng)度。2個(gè)陽(yáng)性克隆序列編碼蛋白分別與CD63抗原和Lumenin蛋白保護(hù)信使同源性最高,生物信息學(xué)分析得出2個(gè)編碼蛋白均是膜蛋白,可能的亞細(xì)胞定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中,都有潛在的B細(xì)胞抗原表位、信號(hào)肽和跨膜螺旋等等。
　　 [結(jié)論]
　　 華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)的篩選,找到了有潛在免疫學(xué)價(jià)值的診