尿路致病性大腸桿菌ppk1基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：大腸埃希菌是機(jī)體正常腸道菌群之一，屬于條件致病菌，主要引起腸道內(nèi)感染一腹瀉；腸道外感染一多為內(nèi)源性感染，以尿路感染（urinary tract infection，UTI）最為常見，還有膽囊炎、新生兒腦膜炎、腹膜炎、敗血癥等。引起尿路感染的大腸桿菌，以部分血清群為主，大部分是屬于O血清型，稱之為尿路致病性大腸桿菌(uropathogenic escherichia coli，UPEC)。尿路感染是臨床上最常見的感染性疾病之一，尤其

2、多見于女性，其次是老年人及兒童，并且復(fù)發(fā)率高。革蘭陰性及陽(yáng)性菌均可導(dǎo)致UTI，但是尿路致病性大腸桿菌占了其中的80-90％[1]。UPEC的感染路線是非常明確的：UPEC與共生的大腸桿菌共同定居于腸道——在毒力島編碼的各種活性因子的作用下移行至尿道-膀胱-沿輸尿管上行進(jìn)入腎臟，大多數(shù)感染發(fā)生在下尿路的膀胱（膀胱炎），但是也會(huì)發(fā)生上尿路感染。UPEC擁有許多不同的毒力因子，包括Afa/Dr粘附素、Ⅰ型菌毛、細(xì)胞毒性壞死因子1、α-溶血素、

3、脂多糖等，這些毒力因子在一定程度上促進(jìn)了UPEC粘附、侵襲宿主細(xì)胞。其中UPEC對(duì)尿路上皮細(xì)胞的粘附能力是其致病的先決條件，其有助于UPEC附著于尿路上皮避免被尿液沖刷清除[2-3]。近幾年來，發(fā)現(xiàn)有些表面上看來是胞外菌的病原體被證明是胞內(nèi)條件性致病菌，作為UTI的主要病原菌，UPEC也位列其中[4]。UPEC能夠侵入宿主細(xì)胞以及尿道上皮組織，并在其中生存繁殖，這有助于其在宿主體內(nèi)有效擴(kuò)散。另外UPEC是生物膜感染的常見病原菌，細(xì)菌感染

4、形成生物膜后，可以發(fā)揮協(xié)同作用，形成復(fù)雜有序的立體結(jié)構(gòu)，逃避免疫系統(tǒng)攻擊，具有較高程度的耐藥性，并可在生物膜解離后播散，導(dǎo)致其他系統(tǒng)的感染[5]。UPEC導(dǎo)致的尿路感染有強(qiáng)烈的復(fù)發(fā)傾向，通常發(fā)生在初次急性感染后的幾周或幾個(gè)月期間，尿路感染的反復(fù)發(fā)作會(huì)導(dǎo)致瘢痕腎，還可增加發(fā)生膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)，加之UPEC對(duì)多種抗生素的耐藥性，給治療帶來極大的困難，尿路感染的治療已成為臨床亟待解決的難題。揭示新的毒力因子及其在尿路感染過程中的作用是現(xiàn)在的首要任

5、務(wù)。聚磷酸鹽激酶1(polyphosphate kinase1，PPK1)是某些細(xì)菌體內(nèi)負(fù)責(zé)催化ATP脫磷酸殘基形成聚磷酸鹽(polyphosphate，poly P)的一種主要激酶，其主要負(fù)責(zé)聚磷酸鹽的合成與ATP的代謝[6]。某些ppk1基因缺失的病原菌，其poly P合成量明顯減少，而且存在毒力缺陷，如生物膜形成、捕食能力、對(duì)外界不利條件的抵抗力、運(yùn)動(dòng)性等均有減弱[7-8]。那么尿路致病性大腸桿菌的ppk1基因缺失，是否會(huì)對(duì)其致病

6、性產(chǎn)生影響，目前并不清楚，而這也正是本文所要探求的問題。UPEC分離株 CFT073基因組測(cè)序已完成，這為我們構(gòu)建基因缺失株，進(jìn)一步研究其致病的分子機(jī)制提供了可能性。
　　方法：以尿路致病性大腸桿菌（CFT073）為研究對(duì)象，利用 Red同源重組技術(shù)敲除CFT073的ppk1基因，構(gòu)建缺失株△pk1；根據(jù)革蘭染色及鏡檢觀察野生株和缺失株的形態(tài)，比較野生株、缺失株的菌落形成能力，并分別繪制出野生株、缺失株的生長(zhǎng)曲線；以人膀胱癌上皮細(xì)

7、胞5637為體外模型，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算細(xì)菌的黏附率和侵襲率，比較野生株、缺失株的粘附與侵襲力；體外比較野生株、缺失株在高熱、高滲透壓及酸性環(huán)境壓力條件下，兩者的生存率變化；采用96孔板結(jié)晶紫染色法分析CFT073 ppk1基因的缺失對(duì)其生物膜形成能力的影響。
　　結(jié)果：⑴以pET28a載體為模板，利用含有同源重組臂的引物通過PCR擴(kuò)增技術(shù)成功構(gòu)建具有卡那抗性1602bp大小的ppk1基因打靶片段。利用卡那霉素抗性挑選出10個(gè)克隆子進(jìn)

8、行正向篩選和反向驗(yàn)證。正向篩選結(jié)果顯示第1、2號(hào)克隆的PCR片段變小，與預(yù)期結(jié)果一致（1978bp）。判斷這兩個(gè)克隆為ppk1基因缺失的菌株。第1，2號(hào)克隆的反向驗(yàn)證擴(kuò)增無1254bp長(zhǎng)度的PCR片段，與預(yù)期結(jié)果一致，這說明第1、2號(hào)克隆在PCR水平被驗(yàn)證了ppk1基因已經(jīng)缺失。最后選取第1號(hào)克隆的正向篩選PCR產(chǎn)物，用兩側(cè)擴(kuò)增引物進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)序列測(cè)序驗(yàn)證可知第1號(hào)克隆為ppk1基因缺失菌株，因?yàn)榈?號(hào)克隆基因組上ppk1基因ORF區(qū)域

9、按設(shè)計(jì)已完全被卡那抗性基因序列替代，而且CFT073本身的基因組序列在測(cè)序范圍內(nèi)未發(fā)生任何突變，說明成功構(gòu)建了CFT073 ppk1缺失株△pk1。⑵革蘭染色顯微鏡觀察，野生株和缺失株均為革蘭氏陰性短桿菌，并無差別。兩菌株在LB固體平板培養(yǎng)基上的菌落大小相近，形態(tài)均為乳白色、濕潤(rùn)、表面光滑的圓形菌落，菌落邊緣整齊，且表面和背面一致。根據(jù)所測(cè)得的OD600值所繪制的生長(zhǎng)曲線，可知野生株和缺失株在營(yíng)養(yǎng)豐富的LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線基本一致，

10、這說明ppk1基因的缺失并不影響菌株?duì)I養(yǎng)豐富時(shí)的生長(zhǎng)。但是ppk1基因敲除株△pk1在低營(yíng)養(yǎng)的MOPS培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)能力較野生株明顯減弱。⑶經(jīng)吉姆薩染色后鏡下觀察比較兩者的粘附菌數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明△pk1對(duì)5637細(xì)胞的粘附能力較CFT073顯著減弱，提示ppk1可影響UPEC對(duì)宿主細(xì)胞的粘附能力。根據(jù)公式計(jì)算出菌株對(duì)膀胱癌上皮細(xì)胞5637的侵襲率，利用SPSS13.0對(duì)所得數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，缺失株侵襲率為（0.18±0.04）%，

11、明顯低于野生株侵襲率（0.48±0.09）%，且P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明ppk1基因的敲除明顯減弱了尿路致病性大腸桿菌CFT073的侵襲能力。⑷比較ppk1缺失株和野生株在熱刺激、高滲透壓以及酸性培養(yǎng)條件下的生存率結(jié)果顯示，ppk1基因敲除后在這些壓力條件下的生存率均明顯下降，這也表明ppk1在CFT073抵抗外界環(huán)境壓力中具有重要作用。⑸用96孔板結(jié)晶紫染色法檢測(cè)野生株與缺失株生物膜形成能力差異，結(jié)果顯示兩菌株在生物膜

12、形成穩(wěn)定之前隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，但缺失株在各時(shí)間段的生物膜形成能力均比野生株明顯減弱。經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，野生株與缺失株之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：①利用Red同源重組技術(shù)可成功敲除CFT073的ppk1基因，從而成功構(gòu)建ppk1基因缺失株△pk1。②ppk1基因?qū)τ?CFT073的形態(tài)和生長(zhǎng)規(guī)律并無太大影響，ppk1缺失株的菌體和菌落形態(tài)以及在LB培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)能力與野生株一致，只是ppk1基