白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-23在炎癥性腸病患者腸粘膜的表達(dá).pdf

1、目的：
　　 炎癥性腸病(IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，到目前為止，該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，治療缺乏特異性，沒(méi)有治愈的方法，目前免疫異常被公認(rèn)為在IBD的發(fā)病過(guò)程中具有極為重要的作用，而白細(xì)胞介素(IL)是其中最主要的具有多種生物活性的一組淋巴因子，本研究通過(guò)對(duì)IBD患者腸黏膜中IL-17、IL-23表達(dá)的研究，探討IBD患者腸黏膜IL-17、IL-23的表達(dá)及與疾病的關(guān)系。
　　 材料和方法

2、
　　 一、一般資料
　　 選擇中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院2003年10月至2007年4月保存有完整資料的診斷明確的CD及同期UC住院患者活動(dòng)期病變部位腸黏膜活檢或手術(shù)標(biāo)本，活動(dòng)期CD組和UC組分別為8例和20例，正常對(duì)照20例。IBD的臨床診斷均依據(jù)于典型的臨床表現(xiàn)、常規(guī)影像學(xué)、內(nèi)鏡學(xué)及組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 二、主要試劑
　　 1、兔抗人IL-17、IL-23單克隆抗體
　　 2、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)

3、顯色試劑盒
　　 3、免疫組化過(guò)氧化物酶標(biāo)志的鏈霉卵白素(SP)試劑盒顯色試劑盒
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 免疫組化檢測(cè)：免疫組化染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶連接(S—P)法。標(biāo)本均經(jīng)10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。全部蠟塊均行4μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，室溫下3％過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)抗原；滴加一抗(兔抗人IL-17、兔抗人IL-23，1：80，)，4℃冷藏過(guò)夜后滴加二抗(山羊抗兔

4、IgG，)，于室溫下孵育30分鐘；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。
　　 四、結(jié)果判定
　　 腸上皮細(xì)胞IL-17、IL-23染色結(jié)果評(píng)價(jià)參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]，IL—17、IL-23染色為細(xì)胞質(zhì)染色：組織切片中顯示細(xì)胞質(zhì)染為淡黃色至黃棕色者為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志，將陽(yáng)性細(xì)胞按其數(shù)量及顯色強(qiáng)度分為3級(jí)：表達(dá)弱陽(yáng)性(+)，即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10％，顯色強(qiáng)度為淡黃色或僅個(gè)別細(xì)胞呈黃至棕黃色染色；表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>60

5、％，多數(shù)細(xì)胞呈黃至棕黃色染色；表達(dá)中度陽(yáng)性(++)，即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及顯色強(qiáng)度介于弱陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性之間。凡顯色強(qiáng)度與背景無(wú)明顯差別者為陰性。腸黏膜固有層內(nèi)IL—17、IL—23表達(dá)以計(jì)數(shù)1000倍高倍鏡下5個(gè)視野內(nèi)平均陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。上述結(jié)果均由兩人雙盲法獨(dú)立判斷，取其平均值。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)，以p<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

6、r>　　 腸黏膜IL—17、IL—23免疫組化染色顯示，IBD患者結(jié)腸上皮細(xì)胞陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)著色；黏膜固有層和淋巴小結(jié)內(nèi)也可見(jiàn)散在陽(yáng)性細(xì)胞。比較活動(dòng)期UC、CD患者腸黏膜上皮細(xì)胞IL—17、IL—23表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UC患者IL—17、IL—23陽(yáng)性染色強(qiáng)度均高于CD患者，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(μ值分別為0.426、0.512，p值均>0.01)。二者分別與正常對(duì)照組比較，均見(jiàn)顯著性差異，其中UC組與正常對(duì)照組比較，IL—17、IL—23陽(yáng)

7、性染色強(qiáng)度均高于對(duì)照組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(μ值分別為4.898、4.513，p值均<0.01)。CD組與正常對(duì)照組比較，IL—17、IL—23陽(yáng)性染色強(qiáng)度亦均高于對(duì)照組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(μ值分別為3.251、3.316，p值均<0.01)。比較活動(dòng)期UC、CD患者腸黏膜固有層內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)UC患者IL—17陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于CD患者，而IL—23陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)低于CD患者，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為1.599、

8、1.825，p值均>0.01)；二者分別與正常對(duì)照組比較，均見(jiàn)顯著性差異，其中UC組與正常對(duì)照組比較，IL—17、IL—23腸黏膜固有層內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均高于對(duì)照組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.691、12.542，p值均<0.01)。CD組與正常對(duì)照組比較，IL—17、IL—23腸黏膜固有層內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)亦均高于對(duì)照組，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.891、8.298，p值均<0.01)。
　　 討論：

9、　　 IBD在西方國(guó)家相當(dāng)常見(jiàn)，近年我國(guó)報(bào)道的病例明顯增多。目前普遍認(rèn)為IBD的發(fā)病機(jī)制與遺傳易感宿主對(duì)腸道菌叢的免疫應(yīng)答失常有關(guān)，其中免疫調(diào)節(jié)異常和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是IBD研究最活躍的領(lǐng)域。
　　 Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一群效應(yīng)性CD4＋T輔助細(xì)胞亞群，其具高致病性，IL—17是一種促炎癥細(xì)胞因子，是Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，它具有強(qiáng)大的募集和激活嗜中性粒細(xì)胞能力。此外，IL—17還可與炎癥因子TNF2α等有協(xié)同作用，放

10、大加強(qiáng)其致炎效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期的IBD患者，UC和CD組結(jié)腸粘膜組織中IL—17高表達(dá)，而在正常對(duì)照組結(jié)腸粘膜組織中IL-17很少表達(dá)，提示在IBD患者結(jié)腸局部浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中可能有Th-17細(xì)胞的存在。IL—23是與IL—12密切相關(guān)的細(xì)胞因子，由相同的p40亞基分別與p35、p19構(gòu)成，IL—23驅(qū)動(dòng)Th17細(xì)胞擴(kuò)增及維持其存活，缺乏IL—23時(shí)，Th17細(xì)胞即明顯減少。早期的IL—23功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)IL—23才是自身免疫性疾

11、病的真正病因。本研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期的IBD患者，UC和CD組結(jié)腸粘膜組織中IL—23高表達(dá)，而在正常對(duì)照組結(jié)腸粘膜組織中IL—23很少表達(dá)，提示IL—23參與了IBD患者結(jié)腸粘膜炎癥反應(yīng)。
　　 總之，本研究顯示，活動(dòng)期IBD患者腸粘膜IL—23、IL—17的表達(dá)較正常對(duì)照均有顯著增強(qiáng)，提示IL—23、IL—17在IBD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL—23通過(guò)誘導(dǎo)并驅(qū)動(dòng)Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL—17、IL—6和TNF2α，引起結(jié)腸炎