卵巢癌腫瘤起始細(xì)胞分離、鑒定及其與化療耐藥相關(guān)性的研究.pdf

1、研究背景:
　　 與目的卵巢癌嚴(yán)重危害婦女健康，其惡性程度居婦科惡性腫瘤首位，因70％的患者在診斷時為晚期，已存在廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)不能完全切凈，故目前國內(nèi)外普遍開展以減瘤手術(shù)和以鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療的綜合治療。80％的卵巢癌患者對順鉑為基礎(chǔ)的一線化療方案是敏感的，遺憾的是約20％的患者可出現(xiàn)原發(fā)性鉑類耐受，而大部分患者在一線化療后又出現(xiàn)繼發(fā)鉑類耐受，導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后極差，5年生存率仍徘徊在30％左右，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。晚期

2、卵巢癌治療的最大障礙是腫瘤細(xì)胞的原發(fā)或繼發(fā)耐藥性的產(chǎn)生。為此，研究卵巢癌耐藥發(fā)生機(jī)理，特別是鉑類耐受的發(fā)生機(jī)理，尋找克服鉑類耐受方法以改善患者預(yù)后是目前亟待研究解決的重要課題。
　　 近幾年來，隨著干細(xì)胞理論在各種腫瘤研究中的廣泛研究和探討，很多研究人員逐漸認(rèn)識到在絕大多數(shù)癌癥中，腫瘤細(xì)胞很可能起源于一種腫瘤起始細(xì)胞，也就是腫瘤干細(xì)胞，它在機(jī)體內(nèi)具有自我更新并形成腫瘤的能力，并且是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。腫瘤干細(xì)胞的存在已在多

3、種腫瘤類型與細(xì)胞系中得到證實，并鑒定出相應(yīng)的分選方法，但人們對這些分選方法卻莫衷一是。在實體瘤中，目前只有乳腺癌的腫瘤干細(xì)胞免疫分型標(biāo)志物得到相對廣泛的認(rèn)可，其他癌癥腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物都存在很大爭議。卵巢癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物目前只有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)報道，而且都是獨(dú)立的實驗室，后續(xù)研究目前還沒有發(fā)表。因此，卵巢癌干細(xì)胞仍需要進(jìn)行廣泛篩選驗證和深入研究，對逆轉(zhuǎn)卵巢癌的化療耐藥有重要意義。本項目逆進(jìn)一步驗證各種分離卵巢癌腫瘤起始細(xì)胞的各種方法，包括免

4、疫分型法、側(cè)群細(xì)胞法、體外無血清懸浮培養(yǎng)法，對各種方法得到的相應(yīng)腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)一步驗證，從實體瘤腫瘤干細(xì)胞的角度來研究耐藥機(jī)制，為腫瘤的靶向治療提供了新思路。
　　 方法:
　　 1.腫瘤起始細(xì)胞分離方法：（1）基于熒光激活細(xì)胞分選法的免疫表型分選法；（2）側(cè)群細(xì)胞分離法；(3)懸浮細(xì)胞球的培養(yǎng)法2.腫瘤起始細(xì)胞干性特征鑒定：（1）RT-PCR鑒定各種干細(xì)胞標(biāo)志物在各種卵巢癌細(xì)胞系及分離的腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)；（

5、2）體外無血清培養(yǎng)單細(xì)胞克隆形成條件的摸索；（3）卵巢球體形成及傳代培養(yǎng)條件（4）流式細(xì)胞儀檢測分離得到細(xì)胞的細(xì)胞周期；（5）體外Borden小室法檢測細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力；（6）體內(nèi)皮下移植瘤形成實驗檢測分離得到的細(xì)胞的成瘤能力及轉(zhuǎn)移潛能3.腫瘤干細(xì)胞與化療耐藥相關(guān)性研究：（1）體外不同濃度化療藥物誘導(dǎo)后流式細(xì)胞儀檢測側(cè)群細(xì)胞變化；RT-PCR檢測耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)變化；（2）流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI 檢測細(xì)胞對化療藥凋亡率；

6、r>　　 結(jié)果:
　　 1.幾種分離體外卵巢癌細(xì)胞系腫瘤起始細(xì)胞方法結(jié)果差異比較大，流式細(xì)胞免疫分型法沒有檢測到CD133及CD117陽性的細(xì)胞群，只檢測到CD44表達(dá)陽性的細(xì)胞群。體外無血清懸浮培養(yǎng)法可以得到卵巢球體細(xì)胞，但是獲得的細(xì)胞特性不穩(wěn)定，傳代效果不佳，不適合長時間培養(yǎng)和實驗研究。側(cè)群細(xì)胞法可以得到較穩(wěn)定的卵巢癌腫瘤干細(xì)胞群，缺點(diǎn)是比例較低，得到細(xì)胞較少。后續(xù)研究主要采用側(cè)群細(xì)胞分離法得到卵巢癌腫瘤干細(xì)胞。
　

7、　 2.側(cè)群細(xì)胞相對于非側(cè)群細(xì)胞，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物如Oct4，Sox2、Bim1等，體外單克隆形成能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯高于非側(cè)群細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，側(cè)群細(xì)胞G0期細(xì)胞有阻滯現(xiàn)象。動物實驗發(fā)現(xiàn)500個側(cè)群細(xì)胞可以形成皮下移植瘤，是非側(cè)群細(xì)胞成瘤能力的100倍。側(cè)群細(xì)胞對動物的致死率較高，體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，轉(zhuǎn)移部位主要在肺表面。
　　 3．側(cè)群細(xì)胞的比例與細(xì)胞系耐藥性成正比。體外化療藥物誘導(dǎo)后，側(cè)群細(xì)胞比例增加，細(xì)胞周期也

8、發(fā)生G0期阻滯，耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)增高。體外實驗檢測得到側(cè)群細(xì)胞對化療藥物敏感性明顯低于非側(cè)群細(xì)胞，并且有高度耐藥的特性。
　　 結(jié)論:
　　 1．卵巢癌細(xì)胞系有腫瘤干性樣細(xì)胞存在。CD44可能是卵巢癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一，而CD133、CD117是否能作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物還需要進(jìn)一步確認(rèn)。
　　 2.側(cè)群細(xì)胞分離法是一種研究腫瘤起始細(xì)胞比較穩(wěn)定的方法，缺點(diǎn)是得到的細(xì)胞量較少。
　　 3.側(cè)群細(xì)胞表現(xiàn)出干性