n-3、n-6多不飽和脂肪酸對3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的影響及PPARγ介導(dǎo)的機(jī)制.pdf

1、背景:
　　 如今，肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等肥胖相關(guān)疾病的患病人數(shù)急劇增加，正給人類健康及社會發(fā)展帶來巨大負(fù)擔(dān)，因此越來越多人開始研究此類疾病的預(yù)防和治療措施。近十年來的研究表明，脂肪組織不僅可以儲存能量，還具有內(nèi)分泌的功能。脂聯(lián)素(adiponectin)(.)作為脂肪組織合成和分泌的脂肪細(xì)胞因子具有減輕體重、調(diào)節(jié)糖脂代謝、調(diào)節(jié)生育功能、改善胰島素抵抗、抗炎抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用。多不飽和脂肪酸如n-3系的二十二碳

2、六烯酸(Docosahe--xaenoicacid，DHA)、二十碳五烯酸（EicosapentaenoicAcid，EPA）和n-6系的亞油酸(Linoleicacid，LA)、花生四烯酸（Arachidonicacid，AA），在調(diào)節(jié)糖脂代謝和脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，但其調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素表達(dá)的作用機(jī)制還不完全清楚。
　　 目的:
　　 以體外培養(yǎng)的3T3-L1脂肪細(xì)胞為研究對象，以不同濃度n-3、n-6多不飽和

3、脂肪酸（Polyunsaturatedfattyacid，PUFA）為處理因素，檢測其對3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA和PPARγmRNA表達(dá)的影響，并初步探討n-3、n-6PUFAs通過PPARγ調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)的可能機(jī)制，對防治代謝綜合癥和2型糖尿病等肥胖相關(guān)疾病提供新思路和理論依據(jù)。
　　 方法和內(nèi)容:
　　 選用濃度為0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、4

4、00μmol/L的DHA、EPA、LA處理體外培養(yǎng)成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞24h，實(shí)時熒光定量PCR(real-timePCR，RT-PCR)檢測處理前后脂聯(lián)素和PPARγmRNA的表達(dá)水平。并選用100μmol/L的DHA、EPA、LA分別加與不加過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)拮抗劑GW9662處理分化成熟的脂肪細(xì)胞24h，實(shí)時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡反應(yīng)(western-blotting)分別測定脂聯(lián)素mRNA表達(dá)

5、和蛋白分泌水平?？紤]到多不飽和脂肪酸受自由基等有害物質(zhì)攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化，檢測高濃度多不飽和脂肪酸下調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)和分泌是否與脂質(zhì)過氧化有關(guān)，收集24h細(xì)胞培養(yǎng)液，測定其中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物轉(zhuǎn)移酶(GSH)濃度。
　　 所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析，運(yùn)用單樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行樣本均數(shù)與已知總體均數(shù)的比較。運(yùn)用方差分析進(jìn)行多個樣本均數(shù)比較，進(jìn)行方差

6、分析之前先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如果方差齊，運(yùn)用方差分析和LSD法分別進(jìn)行多組比較和兩兩比較;如果方差不齊，運(yùn)用Welch法和Dunnett’sT3法分別進(jìn)行多組比較和兩兩比較。統(tǒng)計結(jié)果給出方差是否齊結(jié)果，多組比較的F值和P值，兩兩比較的P值。用Pearson相關(guān)分析兩變量之間是否存在相關(guān)關(guān)系，統(tǒng)計結(jié)果給出Pearson相關(guān)系數(shù)r值和P值，P＜0.05為差異顯著。
　　 結(jié)果:
　　 (1)n-3PUFAs對脂聯(lián)素和PPAR

7、γmRNA的表達(dá)水平的影響:不同濃度DHA對脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平影響的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=59.944，P＜0.001;F=41.051，P＜0.001)。與對照組相比，當(dāng)DHA濃度為50μmol/L至100μmol/L時，脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平均增加，其中DHA濃度為100μmol/L時，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量最高(P＜0.001)，隨著濃度的增加脂聯(lián)素表達(dá)和PPARγmRNA均降低，當(dāng)DHA濃度為400μm

8、ol/L時，脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)量最低，Pearson相關(guān)分析得r=0.775，P＜0.001;不同濃度EPA對脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平影響的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=140.564，P＜0.001;F=27.601，P＜0.001)，當(dāng)EPA濃度為25μmol/L時，脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平最高(P＜0.001)，當(dāng)EPA濃度在50μmol/L至100μmol/L時，脂聯(lián)素和PPARγmRNA均增加，但隨著濃

9、度增加脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)逐漸降低，當(dāng)EPA濃度為400μmol/L時，脂聯(lián)素和PPARγ1mRNA表達(dá)量最低，但無顯著性差異。Pearson相關(guān)分析得r=0.678，P=0.001。
　　 (2)n-6PUFAs對脂聯(lián)素和PPARγmRNA的表達(dá)水平的影響:不同濃度LA對脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平影響的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.752，P＜0.001;F=76.943，P＜0.001)，與對照組相比，當(dāng)LA

10、濃度為50μmol、100μmol/L時，脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平均增加(P=0.060、0.276)，其中脂聯(lián)素在50μmol時表達(dá)量最高，隨著濃度的增加二者表達(dá)水平均降低，當(dāng)LA濃度為400μmol時，脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平最低，Pearson相關(guān)分析得r=0.798，P＜0.003。
　　 (3)n-3、n-6PUFAs中加入PPARγ拮抗劑GW9662對脂聯(lián)素和PPARγmRNA(.)的影響:n-3

11、、n-6PUFAs中加入PPARγ拮抗劑GW9662時脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達(dá)水平影響的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.033，P=0.002;F=130.858，P＜0.001)，與對照組相比，在100μmol/LDHA、EPA、LA中加入100μmol/LGW9662后，脂聯(lián)素和PPARγmRNA均顯著降低。
　　 (4)n-3、n-6PUFAs對脂聯(lián)素蛋白分泌的影響:與對照組相比，100μmol/L的LA、DHA、EPA

12、處理后，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素蛋白分別增加109.56％(P=0.030)、221.89％(P=0.020)、110.62％(P=0.008)，差異具有顯著性;在PUFAs中加入GW9662處理后，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素蛋白分別降低94.83％(P＜0.001)、83.04％(P＜0.001)、88.46％(P＜0.001)，差異具有顯著性。
　　 (5)各濃度DHA、EPA、LA細(xì)胞培養(yǎng)液脂質(zhì)過氧化程度:當(dāng)各組脂肪酸濃度為100μmol/

13、L時，MDA含量最低，隨著濃度增加，MDA含量逐漸提升，差異具有顯著性;SOD活力和GSH水平在高濃度PUFAs作用下有提升。
　　 結(jié)論:
　　 (1)在一定濃度范圍內(nèi)，n-3、n-6PUFAs對脂聯(lián)素表達(dá)的影響呈劑量依賴關(guān)系。DHA、EPA、LA分別在100μmol/L、25μmol/L、50μmol/L濃度時，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量最高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。生理濃度下(100μmol/L)，n-3PUFAs比n-6PUF

14、As更能促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的表達(dá)和分泌。超過生理濃度2倍以上時，n-3、n-6PUFAs均顯著降低脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素的表達(dá)。
　　 (2)生理濃度下n-3、n-6PUFAs與PPARγ激動劑Pioglitazone一樣，可以同時提高脂聯(lián)素表達(dá)和分泌水平，但給予PPARγ拮抗劑GW9662可以顯著阻斷其對脂聯(lián)素表達(dá)和分泌的促進(jìn)作用，故推測PUFAs可能是通過PPARγ途徑調(diào)控脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素表達(dá)。
　　 (3)高濃度多不飽和脂

15、肪酸降低脂聯(lián)素表達(dá)可能與高濃度時多不飽和脂肪酸更易發(fā)生脂質(zhì)過氧化有關(guān)。
　　 創(chuàng)新點(diǎn):
　　 脂聯(lián)素是目前倍受關(guān)注的防治肥胖，糖尿病等代謝綜合征極具潛力的分子靶點(diǎn)，目前的研究一致認(rèn)為膳食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變是導(dǎo)致肥胖以及與之相關(guān)的胰島素抵抗、糖尿病等主要環(huán)境因素，高脂肪飲食及脂肪酸構(gòu)成不合理可能是其中的重要誘因之一，國內(nèi)外研究鮮有報道n-3、n-6多不飽和脂肪酸對脂聯(lián)素表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)則通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，側(cè)重研究多