羅格列酮對2型糖尿病大鼠腎臟VEGF表達的調節(jié)作用.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎功能衰竭的重要原因。糖尿病腎病的確切發(fā)病機制尚未完全闡明，隨著世界范圍糖尿病患者人數(shù)的增加，闡明DN的發(fā)病機制，尋找和發(fā)現(xiàn)有效防治糖尿病腎病的新方法已成為醫(yī)學界研究的重要課題。近年已有研究證實血管內皮生長因子(VEGF，vascularendothelialgrowthfactor)在糖尿病腎病的發(fā)病過程中具有重要作用。已有報道V

2、EGF和VEGF受體在腎臟均有表達，VEGF通過與其特異性受體結合而發(fā)揮多種生物效應。目前，有關VEGF在糖尿病腎臟表達的變化及其在糖尿病腎病中的作用報道較少。已有的研究表明，在糖尿病腎病早期，血漿VEGF水平增高；體內應用VEGF抗體可以改善早期糖尿病腎病引起的腎功能不全；體外實驗表明高糖可刺激培養(yǎng)的腎系膜細胞VEGFmRNA表達增多。綜合以上研究結果，推測VEGF很可能在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。因此研究糖尿病腎臟VEGF的

3、表達變化，尋找和發(fā)現(xiàn)調控腎臟VEGF表達和功能的藥物，對闡明糖尿病腎病發(fā)病機制和有效的治療方法具有重要意義。 噻唑烷二酮類(thiazolidinedine，TZD)是胰島素增敏劑，盡管TZD對糖尿病腎病治療機制未完全闡明，研究結果表明TZD對糖尿病腎病與ACEI類藥物一樣有良好的療效，有關TZD是否通過調控糖尿病腎臟VEGF的表達，改善腎臟功能，目前鮮有報道。因此，本研究擬觀察STZ誘導的大鼠糖尿病模型腎臟VEGF的表達變化，

4、并應用TZD類藥物羅格列酮(rosiglitazone)進行干預，探討TZD對糖尿病大鼠腎臟VEGF表達的調控和對糖尿病腎病的治療作用。闡明TZD類藥物治療糖尿病腎病的機制。 方法：健康Wistar雄性大鼠60只，適應性喂養(yǎng)2周，隨機分為普通飲食組(A組)15只，和高脂飲食組，45只，給予高脂飲食喂養(yǎng)2月，按李光偉HOMA指數(shù)判斷出現(xiàn)胰島素抵抗后，腹腔注射STZ(streptozotocin，STZ)造模。將高脂飲食大鼠隨機分為

5、三組(每組15只)，2型糖尿病未干預組(B組)，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)；羅格列酮治療組(C組)高脂飼料加羅格列酮；，陽性對照苯那普利治療組(D組)高脂飼料加苯那普利，繼續(xù)喂養(yǎng)1月。所有大鼠實驗期間自由飲水、進食。分籠飼養(yǎng)，每籠5只。 每組大鼠均于實驗開始、結束時稱量體重、取血。大鼠自試驗前一日20：00起禁食，試驗日8：00分別自內眥靜脈采血，分離血清，保存于-20℃，用于各指標的檢測。實驗結束時留取部分腎組織液氮保存，用于測定VEG

6、FmRNA表達，部分組織4％戊二醛固定，行電鏡檢測，其余部分以4％中性多聚甲醛固定，待組織學檢查。 1血糖、胰島素的測定。 血糖用葡萄糖氧化酶法測定；胰島素用放射免疫法測定。采用穩(wěn)態(tài)模型(HomeoestasisModelAssessment，HOMA)及胰島素敏感指數(shù)(InsulinSensitivityIndex，ISI)評價胰島素抵抗的程度。 2血脂的測定 甘油三脂(triglyceride，TG)

7、、總膽固醇(totalcholesterole，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoprotein-cholesterole，HDL-C)比色法測定，低密度脂蛋白膽固醇(lowerdensitylipoprotein-cholesterole，LDL-C)由Friedewald公式(LDL-C=TC-HDL-TG/2.2)求出(以mmol/L計)。Cu+比色法測定游離脂肪酸(FFAs)含量。 3腎組織VEG

8、FmRNA表達的測定 用TrizolKit提取腎組織RNA，反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分別擴增VEGF和β-actinmRNA，擴增產物經瓊脂糖電泳、攝片和計算機圖像掃描。RT-PCR產物半定量：因β-actin在組織中均勻表達，VEGF基因的表達水平用靶基因與β-actin的比值表示。 4腎臟細胞形態(tài)學檢查 常規(guī)方法制備大鼠腎臟光鏡組織切片，行HE及VEGF免疫組化染色。制備電鏡超薄切片，透射電鏡觀察

9、腎臟超微變化。 5統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據用SPSS13.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析和直線相關分析作統(tǒng)計學處理。檢驗的顯著性用P值表示。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。 結果： 1對體重的影響 實驗初，大鼠隨機分組，各組體重無統(tǒng)計學差別，具有可比性。實驗末，模型組體重(396.91±25.49g

10、)明顯高于正常對照組(340.43±15.72g)，有顯著性差異(P＜0.01)。羅格列酮干預組(384.87±18.5g)和苯那普利干預組(380.39±16.3g)體重仍均高于正常對照組(P＜0.01)，但明顯低于模型組(P＜0.01)。 2對血糖和胰島素的影響 STZ造模前各組大鼠空腹血糖無差別。腹腔注射STZ后，模型組血糖(15.68±2.74)明顯高于正常組(5.30±0.47)，有顯著性差異(P＜0.01)。

11、羅格列酮干預組血糖和苯那普利干預組的空腹血糖，與正常對照組相比均有顯著性差異，均明顯低于模型組(P＜0.01)，羅格列酮和苯那普利干預組血胰島素與正常組相比無顯著性差異。 3對血脂的影響 STZ造模后模型組大鼠的(TC)、(TG)、(LDL)、及FFA均明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01)。HDL降低，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01)。羅格列酮干預組的FFA比模型組明顯降低，但仍高于正常組。洛汀新組

12、變化不明顯。 4腎臟病理形態(tài)的改變 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎小球體積增大、腎小管擴張，系膜區(qū)增寬。苯那普利和羅格列酮治療有效抑制腎小球體積的增大。電鏡下腎小球超微結構顯示，模型組大鼠腎小球基底膜厚度較正常對照組顯著增厚，足細胞損傷明顯，部分足突融合。羅格列酮干預組和苯那普利干預組無論是基底膜增厚還是足突融合都有非常顯著的改善(P＜0.05)。 5腎組織VEGFmRNA表達水平的變化 應用RT-PCR我

13、們發(fā)現(xiàn)四組大鼠中均有VEGF和β-actinmRNA的表達。VEGF共有三種亞型，其中VEGF120和VEGF164優(yōu)勢表達。在正常對照組大鼠腎組織VEGFmRNA(0.018±0.008)少量表達而模型組(0.497±0.063)高表達，羅格列酮干預組(0.411±0.029)和苯那普利干預組(0.411±0.029)比模型組明顯降低，但仍高于正常對照組。 6免疫組化腎小球VEGF蛋白表達水平的變化 模型組腎小球VEG

14、F表達水平(0.301±0.021)較正常對照組(0.177±0.021)顯著升高(P＜0.05)；羅格列酮干預組(0.239±0.035)和苯那普利干預組(0.274±0.027)均明顯低于模型組(P＜0.05)。 結論： 1長期高脂飼養(yǎng)并小劑量STZ腹腔注射可成功復制2型糖尿病實驗模型，表現(xiàn)在血糖、血脂增高，胰島素敏感性降低。同時大鼠腎臟出現(xiàn)糖尿病腎病的病理變化，如腎小球肥大，系膜基質增多，腎小球濾過膜(基底膜)增厚