Hippo信號通路在小鼠牙齒中的作用研究.pdf

1、背景和目的：
　　 Hippo信號通路中的抑癌基因Mst1/2-Sav1和Lats1/2-Mob的激活會導致YAP/TAZ的磷酸化，并促使其在胞漿中降解。YAP/TAZ也受細胞與細胞接觸的影響，這種影響主要是靠通過緊密連接和粘附來發(fā)揮作用的。抑制Hippo信號通路會導致YAP/TAZ活化，并導致其核轉(zhuǎn)移。一旦與細胞結(jié)合位點TEAD1-4，p53等結(jié)合就會啟動他們的高表達。先前研究顯示Hippo信號通路，通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡來調(diào)

2、控組織器官的大小。Yap激活后可逆性增加肝臟大小超過4倍，但是持續(xù)性過表達則會引起肝癌，Yap在心肌細胞中的過表達會導致心肌細胞增生使的相鄰腔隙閉塞從而導致心肌增生。Yap在小鼠胚胎干細胞分化過程中是被抑制甚至是失活的，但是在誘導多能干細胞(iPS)的過程中是被激活而且高表達。在小鼠胚胎干細胞的發(fā)育過程中將Yap敲除會導致它多能型的喪失，相反如果Yap過表達則會導致胚胎干細胞分化功能的受阻。此外，Yap也調(diào)節(jié)組織特異性祖細胞的發(fā)育，小腸

3、上皮中Yap的表達一般被限制在正常小鼠小腸上皮祖細胞，Yap的基因的過表達，在小鼠腸道導致的細胞祖細胞高度聚集且分化能力降低;而Yap在小鼠皮膚中的過表達會導致在小鼠皮膚表皮基底細胞巢擴大，并抑制其終末分化。在哺乳動物中，Yap也顯示出它在組織再生中發(fā)揮著重要的作用。在野生型小鼠Yap僅能在小腸隱窩上皮細胞中檢測到，但是在葡聚糖硫酸鈉誘導腸道損傷明顯誘導Yap的表達，如果Yap缺失，腸道損傷再生受到阻礙。同時在Yap基因敲除小鼠肝發(fā)育中

4、不僅導致肝細胞的凋亡也導致了在膽管的發(fā)育中出現(xiàn)障礙。
　　 小鼠切牙是不斷生長的，這種現(xiàn)象持續(xù)存在于它的整個生命周期，這種現(xiàn)象的發(fā)生是受存在于小鼠唇側(cè)上皮干細胞支持的。牙源性上皮干細胞產(chǎn)生內(nèi)釉上皮，星狀網(wǎng)，中間層和外釉質(zhì)上皮層，并且能夠分化成釉細胞。唇側(cè)頸環(huán)上皮干細胞的增殖和遷移，分化為成釉細胞并沿唇面逐步礦化成為牙釉質(zhì)。相比之下，舌側(cè)頸環(huán)包含較少增殖的干細胞，在切牙齒的舌面則缺乏牙釉質(zhì)的形成。
　　 Pitx2基因被證

5、明在小鼠早期牙胚的發(fā)育中起到很重要的作用，Pitx2基因編碼三種異構(gòu)體，小鼠Pitx2a，Pitx2b和Pitx2c和第四種Pitx2亞型Pitx2d，這種亞型僅存在于人類中Pitx2a，Pitx2b和Pitx2c亞型在牙源性上皮中表達，而且持續(xù)表達與在牙齒上皮結(jié)構(gòu)。因此可以利用Pitx2作為驅(qū)動子來產(chǎn)生特定細胞種類或特定區(qū)域內(nèi)的基因敲除，或者是基因的過表達。
　　 本研究主要通過采用熒光示蹤來展示Pitx2-Cre基因在小鼠切

6、牙及磨牙發(fā)育過程中的蕾狀期，帽狀期，鐘狀期，分泌期的表達，同時檢測Yap基因在小鼠牙齒發(fā)育過程中時空特異性表達模式，并且在牙源性上皮特定敲除和敲入Yap基因，觀察其對小鼠牙齒發(fā)育的影響。
　　 方法：
　　 Pitx2-Cre;TomatoAi14;C57不同時期胚胎的獲取后，冰凍切片后用熒光示蹤方法檢測Pitx2-Cre基因在小鼠牙齒發(fā)育不同階段表達，同時用原位雜交技術檢測Yap基因在小鼠牙齒發(fā)育過程中時空特異性表達。

7、利用Pitx2-Cre在牙源性上皮中表達模式，構(gòu)建Yap的條件敲除小鼠，以及轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測Yap基因在牙源性上皮細胞及牙齒發(fā)育中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 Part1
　　 1.Pitx2-Cre基因可從帽狀期，鐘狀期，分泌期均可見到Pitx2-Cre基因在磨牙與切牙的內(nèi)釉上皮，外釉上皮，以及cervicalloop區(qū)域高表達。
　　 2.在蕾狀期，帽狀期，鐘狀期，分泌期的磨牙及切牙中均可見到Y(jié)ap的

8、表達，其主要分布區(qū)域在上皮細胞層，Yap基因可在頰側(cè)與舌側(cè)的頸環(huán)區(qū)域表達，在間充質(zhì)細胞表達較弱。
　　 Part2
　　 1.Pitx2-Cre;Yapflox/flox與正常小鼠比較其體型沒有改變，顏面部發(fā)育正常，未見牙列缺損，但是牙齒的色澤茭白，而且牙齒形態(tài)較小，左右不對稱，表面光滑度較差。磨牙區(qū)牙釉質(zhì)呈現(xiàn)低密度影像，咬合面牙釉質(zhì)缺損嚴重，牙冠近遠中面可見牙釉質(zhì)發(fā)育不全不能完整覆蓋近遠中側(cè)，但牙冠的頰舌面發(fā)育正常，牙

9、齒的外形高點線位置發(fā)生改變，牙根較正常組粗大，牙周膜不明顯;切牙舌側(cè)出現(xiàn)高密度影像，即異位表達的牙釉質(zhì)，同時頰側(cè)的牙釉質(zhì)覆蓋范圍減少，僅在靠近中線處有少量牙釉質(zhì)覆蓋。
　　 2.掃描電鏡顯示切牙形態(tài)小，切牙切端呈現(xiàn)切割狀，牙釉質(zhì)基本結(jié)構(gòu)釉柱較少，即使存在少量的釉柱也被包裹在無定型的基質(zhì)中間。磨牙顯示萌出時間晚于正常，而且牙尖發(fā)育異常，在牙尖周圍可見大量散落的小的釉珠。
　　 3.HE染色顯示，在E14.5天下頜第一磨牙區(qū)

10、未見明顯異常，E16.5/E18.5磨牙形態(tài)減小，牙乳頭及牙囊未見明顯發(fā)育異常，內(nèi)釉上皮層，外釉上皮層斷裂，在星網(wǎng)狀層顯示有較大血管的形成，并且顯示向牙乳頭層方向侵入生長;E16.5/E18.5天切牙cervicalloop減小，牙乳頭及牙囊未見明顯發(fā)育異常。
　　 4.Insitu顯示Pitx2-Cre;Yapflox/flox基因敲除小鼠E18.5cervicalloop區(qū)域出現(xiàn)Fgf3與Fgf9的表達;Msx1的表達降低;

11、Amelogenin表達在切牙舌側(cè)出現(xiàn)表達證明舌側(cè)異位牙釉質(zhì)的出現(xiàn);Dspp的表達在E18.5的切牙舌側(cè)的成牙釉質(zhì)細胞與成牙本質(zhì)細胞，而正常小鼠僅在切牙舌側(cè)成牙本質(zhì)細胞表達;p21的表達在未見明顯異常表現(xiàn);MMP20/Follistatin的表達也出現(xiàn)在舌側(cè)成牙釉質(zhì)細胞層，F(xiàn)ollistatin在唇側(cè)成釉細胞表達增強。
　　 Part3
　　 1.Pitx2-Cre;YAPTg轉(zhuǎn)基因小鼠體型變小，可見牙列缺損。磨牙區(qū)牙釉

12、質(zhì)呈現(xiàn)低密度影像，牙根較正常組短，牙周膜不明顯，牙冠近遠中面及頰舌面未見牙釉質(zhì)覆蓋，但是在牙冠內(nèi)區(qū)域出現(xiàn)環(huán)狀影像;切牙牙釉質(zhì)覆蓋范圍減少，僅在靠近中線處有少量牙釉質(zhì)覆蓋未見異位表達牙釉質(zhì)。
　　 2.HE染色顯示，在E14.5/E16.5/E18.5磨牙牙乳頭及牙囊未見明顯發(fā)育異常，成釉器外釉上皮層，星網(wǎng)狀層發(fā)育未見明顯異常，E16.5內(nèi)釉上皮層輕微增生;E18.5內(nèi)釉上皮層向星網(wǎng)狀層方向增生，cervicalloop區(qū)域膨大。

13、在E16.5/E18.5牙乳頭及牙囊未見明顯發(fā)育異常，E16.5切牙cervicalloop增加，在E18.5天切牙cervicalloop膨大明顯，在外釉上皮層出現(xiàn)增生。
　　 3.Brdu染色顯示，在E16.5/E18.5天下頜第一磨牙牙乳頭及牙囊未見明顯異常，成釉器外釉上皮層/cervicalloop內(nèi)釉上皮區(qū)域增值未見明顯異常;在E16.5/E18.5天下頜切牙牙乳頭及牙囊，成釉器內(nèi)釉上皮層未見明顯異常，E18.5cer

14、vicalloop區(qū)域外釉上皮區(qū)域增值顯著增多，而E16.5不明顯。
　　 4.Fgf3在E14.5未見明顯改變E16.5下頜第一磨牙的表達稍微降低，在E18.5cervicalloop區(qū)域不表達，在靠近cervicalloop區(qū)域的牙乳頭區(qū)域表達降低;Fgf9的表達增強并且在舌側(cè)cervicalloop表達;Msx1的表達在E16.5，E18.5下頜第一磨牙及切牙cervicalloop表達強度差異改變不大，但是表達區(qū)域也發(fā)生

15、改變，在上皮層可見到表達;Amelogenin表達強度差異不明顯;Dspp的表達在E18.5的切牙區(qū)前段表達增加;p21的表達在E18.5的切牙區(qū)頂端表達增強。
　　 結(jié)論：
　　 1.Yap在正常小鼠牙齒的發(fā)育中是持續(xù)表達的，Yap的表達位置與強度具有時空特異性;Pitx2-Cre能夠驅(qū)動特定基因在牙源性上皮細胞中表達。
　　 2.Pitx2-Cre介導的牙源性上皮細胞特定敲除Yap后，在牙齒發(fā)育鐘狀期開始出現(xiàn)

16、內(nèi)釉上皮層的斷裂，在成體小鼠會顯著促進切牙舌側(cè)成釉細胞的分化，出現(xiàn)異位牙釉質(zhì);抑制唇側(cè)頸環(huán)干細胞增殖，導致唇側(cè)牙釉質(zhì)發(fā)育障礙;切牙頰側(cè)頸環(huán)減小;磨牙體積減小，近遠中側(cè)牙釉質(zhì)發(fā)育障礙;牙齒萌出時間延緩。
　　 3.Pitx2-Cre介導的牙源性上皮細胞過表達Yap后，在牙齒發(fā)育鐘狀期開始出現(xiàn)內(nèi)釉上皮層增殖增多，頸環(huán)膨大，在成體小鼠會顯著抑制成釉細胞的分化，導致切牙及磨牙牙釉質(zhì)大面積缺失，牙齒的形態(tài)減小，伴隨牙列缺損;切牙頰側(cè)頸環(huán)增