同種異體骨髓單個核細胞移植治療大鼠急性心肌梗死的研究.pdf

1、全文分為三部分： 第一部分： 目的：探討大鼠骨髓單個核細胞的提取、分離培養(yǎng)和體外擴增的最佳條件，觀察在體外培養(yǎng)時骨髓單個核細胞的生長狀況和生物學特性。 方法：通過密度梯度離心法從成年大鼠骨髓中分離骨髓單個核細胞，用含15％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)擴增；利用貼壁培養(yǎng)法分離純化，分離出骨髓間充質干細胞，并傳代擴增，觀察不同培養(yǎng)時間的細胞形態(tài)及生物學特性。 結果：骨髓單個核細胞培養(yǎng)4天時形成由骨髓間充質干細胞

2、組成的細胞集落；5-12天時，細胞生長迅速，出現(xiàn)較大集落，貼壁生長，成集落生長的細胞生長速度顯著快于散在生長的細胞；14天后，細胞融合成單層，排列成漩渦狀或放射狀。用0.25％胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，傳代細胞增殖較快，約5天可傳一代，傳至3代時細胞基本純化，但隨著傳代次數(shù)的增加細胞增殖速度變慢并出現(xiàn)多倍體核型。 結論：經密度梯度離心法獲取的骨髓單個核細胞內含有較多骨髓間充質干細胞，利用貼壁培養(yǎng)方法可以對骨髓間充質干細胞進行初步純

3、化。 第二部分： 目的：建立一種穩(wěn)定可重復的急性心肌梗死動物模型，為后期骨髓單個核細胞移植做好準備。 方法：Wistar大鼠20只，隨機分為2組，每組10只，經3％戊巴比妥鈉麻醉后，實驗組開胸結扎左冠狀動脈前降支(LAD)，對照組僅開胸，不結扎LAD，心電監(jiān)測觀察LAD結扎前后心電圖變化，8周后行心臟超聲檢查及病理組織學檢查，檢測心梗模型制備的成功率及對心功能的影響。 結果： 1、試驗組心電監(jiān)測術

4、后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF導聯(lián)ST段持續(xù)抬高>4mm。 2、術前兩組動物心臟超聲心動圖檢查，各項指標均無差異，p>0.05。術后8周超聲心動圖檢查顯示，心梗組收縮期與舒張期心腔內徑與對照組相比，LVEDd增加42.9％，差別顯著(0.902±0.053 VS 0.631±0.015，p<0.001)；LVESd增加1182.5％，與對照組相比，差別顯著(0.794±0.054 VS 0.435±0.028，p<0.001)； ESAW

5、TR較對照組相應指標相比，顯著減低，分別為(0.085±0.042 VS 0.314±0.057，p<0.001)；而ESPWTR較對照組相應指標相比，則顯著增高，分別為(0.594±0.118 VS0.319±0.046，P<0.01)；心梗組與對照組LVEF相比，顯著減低，分別為(0.286±0.053 VS 0.670±0.047.p<0.001)。 3、進行了心梗病理組織學檢查，HE染色及Masson染色顯示缺血部位心肌

6、被纖維結締組織替代，近心內膜處殘留極少量心肌細胞，其余各層內不含有心肌細胞，缺血部位與周圍非缺血部位的分界清晰。 結論： 1.前降支結扎可以造成大鼠前側壁及下壁大面積心肌梗死，心肌梗死后對心功能影響較大。 2.心電圖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF導聯(lián)ST段在LAD結扎后持續(xù)抬高>4mm，可以作為前壁大面積心肌梗死的早期判斷指標。 3.超聲心動圖檢查是觀察試驗大鼠心臟形態(tài)及心功能狀態(tài)的較理想方法，方便動態(tài)觀察，便于追蹤

7、隨訪。 第三部分： 目的：探討急性心肌梗死后骨髓單個核細胞移植對心功能的影響、作用機制及骨髓單個核細胞移植的最佳時機。 方法：成年近交系Wistar雄性大鼠36只，體重170g-200g，隨機抽取10只為對照組(未移植細胞)，10只為心梗后立即細胞移植組，10只為心梗1周后細胞移植組，另外留取6只作為骨髓干細胞供體；截取大鼠的雙后肢，分離骨髓單個核細胞，用DAPI標記待用，同時熒光顯微鏡下觀察DAPI的細胞標記率

8、，留取部分標記過的BMMNCs進行培養(yǎng)；結扎大鼠前降支，制作心梗動物模型，然后將已經標記的BMMNCs2×10<'7>個多點注射到梗死區(qū)域，分組同上；術后8周行超聲心動圖檢查3組大鼠心臟功能，然后處死大鼠，熒光顯微鏡下觀察DAPI標記的細胞，HE染色組織學檢查分析心梗局部毛細血管密度，非心梗區(qū)域心肌細胞行細胞調亡TUNEL分析。 結果： 1.骨髓單個核細胞DAPI標記率為100％，DAPI標記的BMMNCs體外培養(yǎng)能夠成

9、活并成功傳代。 2.術后8周超聲心動圖檢查顯示，對照組(心梗未移植組)、心梗后即刻細胞移植組及心梗后1周細胞移植組EF值分別為(0.299±0.044 VS 0.318±0.042 VS0.591±0.092)，對照組與心梗后即刻細胞移植組相比，P>0.05,無統(tǒng)計學意義，對照組及心梗后即刻細胞移植組分別與心梗后1周細胞移植組EF值比較，p值均<0.001，差別非常顯著；前壁收縮末期室壁增厚率(ESAWTR)在對照組(心梗未治療

10、組)、心梗后即刻細胞移植組及心梗后1周細胞移植組分別為(0.087±0.036VS 0.101±0.020 VS 0.114±0.020)，兩兩比較，P值均>0.05，無統(tǒng)計學差異，但有增高趨勢；后壁收縮末期室壁增率(ESPWTR)在對照組(心梗未移植組)、心梗后即刻細胞移植組及心梗后1周細胞移植組分別為(0.594±0.103 VS0.542±0.092 VS 0.457±0.080)，對照組與心梗后即刻細胞移植組之間：ESPWTR比

11、較，P>0.05，無統(tǒng)計學差異，對照組及心梗后即刻細胞移植組與心梗后1周細胞移植組ESPWTR比較，P值均<0.05，差別顯著。 3.所有移植過BMMNCs的心臟標本切片中未發(fā)現(xiàn)任何細胞核發(fā)DAPI的藍色熒光。 4.心梗區(qū)域毛細血管數(shù)目在對照組、心梗后即刻細胞移植組及心梗后1周細胞移植組分別為(2.14±0.62)VS(2.37±0.74)VS(7.08±1.06)，其中心梗未治療組與心梗后立刻細胞移植組比較，P>0.0

12、5，無統(tǒng)計學差異；心梗未治療組與心梗后立刻細胞移植組分別與心梗后1周細胞移植組比較，P均<0.01，差別顯著。 5.對照組、心梗后即刻細胞移植組及心梗后1周細胞移植組非缺血區(qū)域的心肌細胞凋亡率分別為：(0.098±0.028)VS(0.084±0.025)vs(0.046±0.017)。其中心梗未治療組與心梗后立即細胞移植組比較，P=0.32，無顯著差異；而對照組及心梗后立即細胞移植組分別與心梗后1周細胞移植組比較，P值均顯著<

13、0.01，差別非常顯著。 結論： 1.大鼠心肌梗死1周后，骨髓單個核細胞移植可以明顯改善梗死后8周大鼠的心臟功能；而大鼠急性心肌梗死后立即骨髓單個核細胞移植對大鼠梗死后8周的心臟功能的影響不大。 2.熒光顯微鏡檢查結果提示，心臟功能的改善與骨髓單個核細胞的橫向轉化關系不大。 3.BMMNCs移植可以增加大鼠心肌梗死后8周梗死局部的毛細血管密度，減少心肌細胞的調亡，梗死局部的毛細血管密度的增加及心肌細胞調亡