TRAIL對耐藥相關基因SIRT1作用效應的研究.pdf

1、食管癌(esophageal carcinoma)是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤,占所有惡性腫瘤的2％,我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū),平均每年病死約15萬人,手術后化療是治療食管癌的重要方法之一。近些年,由于藥物的不規(guī)范使用、腫瘤細胞基因的不穩(wěn)定性、表達異質性、高突變率以及個體對化療方案的敏感性差異等原因,導致患者預后很差,腫瘤產生耐藥性是術后腫瘤病人化療失敗及復發(fā)的主要原因之一,因此,降低腫瘤細胞耐藥性成為臨床治療亟待解決的重要問題。<

2、br>　　 沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator type1,SIRT1)是人類的Ⅲ類組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDACs),基因位于10q22.1,長約33 kb,翻譯后的蛋白質分子量大小約為60 KD,具有NAD+依賴的去乙?；富钚?。它在DNA損傷修復、細胞周期控制、抑制細胞凋亡、抵抗氧化逆境和延長細胞壽命方面起著重要作用,因此SIRT1被稱為“長壽基因”

3、。研究表明5種臨床腫瘤的活檢標本和不同細胞來源的耐藥細胞,均發(fā)現SIRT1的高水平表達,能直接誘導多藥耐藥基因的表達。
　　 腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體(Tumor necrosis factor(TNF)-relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)是通過與FasL和TNF有較高的序列同源性被發(fā)現的,又被稱為Apo2L,定位在人類3號染色體3q26上,全長大約有1769bp,分子量大概為32

4、.5KD,它編碼281個氨基酸序列。TRAIL因其能夠有效地抑制并殺死腫瘤細胞但對正常細胞的凋亡作用較小而引起人們的普遍關注。有研究顯示,TRAIL還可與化、放療協(xié)同發(fā)揮作用,從而達到逆轉腫瘤耐受、多要耐藥的目的。但國內關于TRAIL與耐藥基因SIRT1作用關系的研究很少,尚未見報道。本課題研究采用構建真核表達載體pcDNA3.1(+)-TRAIL的方法,用脂質體轉染食管癌細胞來進一步研究TRAIL在食管癌細胞中的表達及其產生的凋亡效應

5、,并初步探討TRAIL對腫瘤耐藥相關基因SIRT1的作用效應,為降低腫瘤耐藥性研究奠定理論基礎。
　　 目的:構建真核表達載體pcDNA3.1(+)-TRAIL,檢測其在食管癌細胞中的表達及產生的凋亡作用,并初步探討TRAIL對腫瘤耐藥相關基因SIRT1的作用效應,為逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性提供實驗基礎。
　　 方法:用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切的方法從原核載體pCA13-TRAIL上切下目的基因TRAIL,回收大約8

6、48bp大小片段,并同時雙酶切真核表達載體pcDNA3.1(+),然后用T4連接酶進行連接,構建重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-TRAIL并用雙酶切進行鑒定；用脂質體2000將重組質粒轉染到人食管癌細胞EC9706中,48h以后用RT—PCR和免疫細胞化學方法分別檢測其在食管癌細胞中mRNA和蛋白水平的表達；光學顯微鏡和倒置相差顯微鏡觀察細胞凋亡過程的一般生物學形態(tài)變化；用流式細胞技術檢測轉染重組質粒24h、48h后對食管癌細胞

7、產生的凋亡效應；RT—PCR和免疫細胞化學法分別檢測重組質粒TRAIL對耐藥相關基因SIRT1的mRNA和蛋白表達水平的影響,初步探討TRAIL對腫瘤耐藥相關基因SIRT1的作用效應。
　　 結果:
　　 1重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-TRAIL的構建及鑒定
　　 用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切pCA13-TRAIL質粒,回收約848bp大小片段,將此片段與同時雙酶切后的pcDNA3.1(+)用T4連

8、接酶連接,構建重組質粒；經雙酶切鑒定后得到的片段大小分別為5400bp左右和800bp左右,說明TRAIL基因成功地克隆到表達載體pcDNA3.1(+)中。
　　 2重組質粒TRAIL基因在食管癌細胞中表達的鑒定
　　 重組質粒用脂質體瞬時轉染食管癌細胞,48h后,提取細胞RNA,RT—PCR結果顯示轉染pcDNA3.1(+)-TRAIL組較未轉染組、轉染pcDNA3.1(+)空質粒組表達量顯著增高,電泳結果經軟件檢測未

9、轉染組、轉染空質粒組和轉染組灰度值與相應內參的比值分別是1.05±0.33、1.05±0.33和1.80±0.35,說明轉染目的基因組TRAIL基因的mRNA表達顯著增強(P<0.05)；轉染48h后,用免疫細胞化學方法檢測顯示TRAIL在細胞膜、質均有表達且轉染目的基因組的棕黃色明顯高于未轉染組,經軟件檢測得到的灰度值分別為118.23±0.46和78.19±0.41,說明轉染后TRAIL基因蛋白水平的表達顯著增高(P<0.05)。<

10、br>　　 3 TRAIL對食管癌細胞的凋亡作用
　　 流式細胞術結果顯示:轉染重組質粒24h未見凋亡曲線,而48h后細胞周期有凋亡曲線,較未轉染組增殖指數減少明顯(P<0.05),說明轉染后48h TRAIL基因的凋亡作用達高峰。
　　 4重組質粒對腫瘤耐藥相關基因SIRT1的作用效應
　　 重組質粒用脂質體瞬時轉染食管癌細胞,48h后,提取細胞RNA,RT—PCR顯示轉染pcDNA3.1(+)-TRAIL組

11、較、未轉染組、轉染pcDNA3.1(+)空質粒組表達量顯著降低,電泳結果經軟件檢測未轉染組、轉染空質粒組和轉染組灰度值與相應內參的比值分別是1.79±0.35、1.79±0.35和1.06±0.32,說明轉染后對耐藥基因SIRT1的mRNA表達顯著抑制(P<0.05)；轉染48h后,用免疫細胞化學方法檢測顯示SIRT1在細胞核、質表達顯著降低幾乎不見棕黃色顆粒,明顯低于未轉染組,經軟件檢測得到的灰度值分別為78.18±0.42和118.

12、24±0.46,說明TRAIL能顯著抑制耐藥相關基因SIRT1蛋白水平的表達(P<0.05)。
　　 結論:
　　 1本實驗成功地構建了真核表達載體pcDNA3.1(+)-TRAIL,并證實其能在人食管癌EC9706細胞中的mRNA和蛋白水平大量表達TRAIL基因。
　　 2本實驗證實了TRAIL基因能對人食管癌EC9706細胞產生凋亡效應。
　　 3本實驗證實了重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-T