人廢棄胚胎來源的胚胎干細(xì)胞建系研究.pdf

1、目的：人胚胎干細(xì)胞起源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán),具有無限自我更新及體內(nèi)外分化成人體任何一種細(xì)胞類型的能力,胚胎干細(xì)胞全能性特征可為細(xì)胞替代治療及藥物篩選提供大量資源。人胚胎干細(xì)胞系1998年就已建立,但是胚胎干細(xì)胞系的發(fā)育潛能和表觀遺傳特性存在很大差異,導(dǎo)致用于人體移植治療時(shí)會(huì)出現(xiàn)HLA免疫排斥問題。國內(nèi)干細(xì)胞株數(shù)遠(yuǎn)不能滿足HLA匹配數(shù),還需要建大量不同胚胎來源的干細(xì)胞株。在大部分IVF胚胎室,受精卵通常培養(yǎng)至第3天(D3),所有胚胎經(jīng)形態(tài)學(xué)評(píng)分

2、后,高評(píng)分胚胎用于移植或冷凍,低評(píng)分胚胎由于發(fā)育潛能不足,序貫培養(yǎng)獲得囊胚著床率低、死亡率及染色體異常率高,通常予以丟棄。盡管形態(tài)學(xué)評(píng)分目前是大多數(shù)生殖中心的胚胎判斷標(biāo)準(zhǔn),但并不是胚胎發(fā)育潛能的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究收集 D3低質(zhì)量廢棄胚胎,序貫培養(yǎng)至 D6,囊胚擴(kuò)張后(3級(jí)及以上)行玻璃化冷凍,凍融后培養(yǎng)至D8或D9接種,本研究在常規(guī)建系方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),嘗試用D6天低質(zhì)量凍融囊胚進(jìn)行干細(xì)胞建系,為人廢棄胚胎干細(xì)胞建系提供材料和方法學(xué)參考

3、。
　　方法：(1)囊胚序貫培養(yǎng)、冷凍:本實(shí)驗(yàn)開始前已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的同意,并且所有提供廢棄胚胎的夫婦均已簽署知情同意書,同意其廢棄胚胎用于科研。收集本中心D3廢棄胚胎行序貫培養(yǎng),獲得的囊胚玻璃化冷凍儲(chǔ)存。
　　(2)胚胎解凍、培養(yǎng):胚胎解凍后序貫培養(yǎng)至D8或D9,觀察囊胚形態(tài)變化,對(duì)含有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的存活囊胚進(jìn)行接種。
　　(3)接種、傳代:接種之前鏈蛋白酶消化去除透明帶,機(jī)械打孔成功后接種,待原代集落長出后

4、,將原代集落接種至事先準(zhǔn)備好的小鼠飼養(yǎng)層上,7天傳代一次。(4)胚胎干細(xì)胞特征鑒定:分別取不同代次的胚胎干細(xì)胞行堿性磷酸酶染色,干細(xì)胞體內(nèi)外分化,免疫組化熒光染色以及染色體核型分析。
　　結(jié)果：(1)囊胚形成率:共收集168枚低形態(tài)學(xué)評(píng)分的D3廢棄胚胎,參照Steer CV的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),所有胚胎的單胚胎評(píng)分均小于16分。序貫培養(yǎng)至D6天共獲得低質(zhì)量囊胚(包括3CB,3BC,4CB,4CC)32枚,復(fù)蘇后存活26枚,囊胚形成率19.0

5、％,復(fù)蘇存活率81.3%。
　　(2)復(fù)蘇、接種后生長狀況:復(fù)蘇后存活的囊胚26枚,均含有不同形狀大小的內(nèi)細(xì)胞團(tuán),分離出原代克隆8個(gè),其中2個(gè)在傳代過程中分化,其余2個(gè)原代克隆準(zhǔn)備傳第2代時(shí)出現(xiàn)污染。我們從一個(gè)4CB及3BC的囊胚成功分離培養(yǎng)出hESC,其中1株已傳36代,另一株已傳20代。
　　(3)hESC的生物學(xué)特性分析:傳代過程中的干細(xì)胞集落表現(xiàn)出典型的干細(xì)胞克隆特征,細(xì)胞間連結(jié)緊密,與周圍飼養(yǎng)層細(xì)胞形成明顯的界限;

6、堿性磷酸酶 AKP染色強(qiáng)陽性;間接免疫熒光著色,干細(xì)胞集落高表達(dá)OCT-4抗體;完整干細(xì)胞集落免疫表型分析顯示細(xì)胞集落TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4表達(dá)陽性。D26,D36染色體核型分析均為正常二倍體核型,46XX。干細(xì)胞集落接種到SCID小鼠腹股溝皮下,10周后形成的畸胎瘤可見3個(gè)胚層的細(xì)胞,包括角化復(fù)層扁平上皮(外胚層)、軟骨(中胚層)以及腸腺上皮(內(nèi)胚層);胚胎干細(xì)胞克隆集落體外懸浮培養(yǎng)14天后形成