灌注法制備大鼠全腎臟脫細胞基質的細胞相容性研究.pdf

1、研究背景：
　　 腎臟是人體重要的生命器官,腎臟疾病嚴重影響著患者的健康和生活質量,針對這種疾病的治療一直受到國內外研究人員的廣泛關注。血液透析和腎臟移植是目前臨床上常用的治療終晚期腎病與急性腎衰的方法,透析只能替代。腎臟的部分功能,腎臟移植則受到移植器官來源有限及移植后引發(fā)免疫排斥反應等因素的限制。因此,針對終晚期腎病和腎衰的治療迫切需要尋找新的技術和手段。隨著組織工程研究的不斷深入,運用組織工程技術研制可供移植的腎臟組織為腎

2、病的治療帶來了新的希望。
　　 組織工程學是一門近年來新興的綜合性學科,是一門運用細胞、工程材料學方法和創(chuàng)造適當生化、理化因素,以改善或替代組織的生物學功能的學科,是人類治療組織、器官的功能衰竭和缺失的研究方向。其基本原理和方法是令少量組織細胞通過體外培養(yǎng)擴增達到一定數(shù)量后,接種到具有一定空間結構的支架上,構成有生命活力的細胞支架復合物,并移植到體內,以達到修復或替代組織損傷的目的。近年來,組織工程學有了迅猛的發(fā)展,對多種組織均

3、有相應的組織工程器官面世的報道,如骨、軟骨、血管、膀胱等,尤其在泌尿系統(tǒng)組織工程學上,國外學者更已將組織工程膀胱投入臨床試驗,成為首個植入人體內的真正意義上的組織工程人造器官。它既為眾多研究者們建立了典范,同時也開啟了更為廣闊的未知領域:是否所有的人體組織均能通過組織工程學的方法創(chuàng)造出人造器官?截至本研究完成前,國內外尚未有組織工程。腎體外構建成功的案例,并且學者們的研究重點均在于如何體外培育腎細胞,而合適的細胞支架則一直鮮有提及。我科

4、實驗性應用灌注法制備大鼠全腎脫細胞基質支架,目前未見其它相關報道,制備的脫細胞基質是否具有良好的細胞相容性尚不確切。
　　 研究目的：
　　 1.探討灌注法制備大鼠的全腎臟脫細胞基質(ACM)支架的條件和方法。
　　 通過對多種細胞支架的比較發(fā)現(xiàn),脫細胞基質(Acellular Matrix)是一種良好的細胞支架。它具有原組織的宏觀及微觀結構,并且富含膠原、彈力纖維,并含微纖維蛋白、纖維結合素、層粘連蛋白、蛋白多

5、糖、透明質酸、硫酸軟骨素等。經脫細胞后留下的細胞外基質成分具有良好的生物相容性,并且各種組成的成分分別攜帶或接收不同的信號,誘導不同的細胞,因而對于細胞類型中基因表達方式,細胞的粘附、移行、轉移等都有極重要的影響。目前制備脫細胞基質的方法基本局限于以酶或去污劑浸泡洗脫,而對實質性臟器基本無法達到脫細胞的目的。本研究以去污劑為洗脫細胞的溶劑,引入灌注法,通過血管、腎小球、腎小管這一自然平臺達到將腎臟內部細胞洗脫的目的,并在研究過程中探討、

6、建立一套系統(tǒng)的制備方法。
　　 2.觀察并證明所制備的全腎臟脫細胞基質具有規(guī)則的三維空間結構,良好的孔隙率,且已將細胞完全洗脫。
　　 由于已將在移植中產生抗原性的最重要成分--細胞洗脫,余下的脫細胞基質不存在MHC抗原。后者所誘發(fā)的免疫反應為類Th-2反應,與異種移植誘發(fā)的典型Th-1反應不同。而這種反應對植入的脫細胞基質并無排斥作用,表明了脫細胞基質具有種屬差異性小、生物相容性佳等優(yōu)點。經本研究建立的方法所制備的脫細

7、胞基質,在肉眼觀察下呈均-白色半透明,我們通過掃描電鏡觀察檢測,從而說明其具有良好的微觀孔隙結構以利于細胞生長,且已將細胞完全洗脫。
　　 3.檢測鼠腎脫細胞基質的細胞相容性；
　　 應用L929細胞檢測鼠腎脫細胞基質的細胞相容性；探討灌注法制備的腎脫細胞基質作為細胞支架,構建泌尿系實質性組織工程器官的可行性。
　　 研究方法
　　 1.大鼠全腎臟脫細胞基質的制備。
　　 取12周齡的whista

8、r大鼠共20只,10％水合氯醛腹腔注射麻醉下完整切除兩側腎臟,分別保留輸尿管、腎靜脈及腎動脈。每對腎臟隨機取1只作對照組,另1只作實驗組。所有腎臟均沿腎動脈插入留置針建立灌注通道。實驗組以肝素化PBS溶液輕推測試通道密閉性完整后,依次灌注肝素化PBS溶液,1％十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液,去離子水,1％TritonX-100溶液以及含青鏈霉素的PBS溶液。調整灌注壓強及灌注時間,經修正獲得最佳方案。
　　 2.采用掃描電鏡觀察支

9、架微觀結構；
　　 經2.5％戊二醛灌注固定,梯度法丙酮脫水、乙酸異戊酯置換、臨界點法干燥、真空噴鍍后掃描電鏡下觀察標本。
　　 3.檢測鼠腎脫細胞基質與L929細胞(鼠成纖維細胞)的細胞相容性；
　　 (1)培養(yǎng)L929細胞作為種子細胞,設立空白組(無細胞)、陰性對照組(培養(yǎng)基)和實驗組(鼠腎脫細胞基質浸提液)及陽性對照組(含O.64％苯酚溶液的培養(yǎng)基)。取對數(shù)生長期的L929細胞,4x103/孔接種于96孔板

10、中,每組各5孔,于接種24,72,120 h,通過MTT法顯色,于酶標儀490nm波長下檢測吸光度值,計算相對增殖率。
　　 統(tǒng)計方法:實驗結果以平均值士標準差表示((x)±s),應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,對第24、72和120小時三個時間各組實驗結果進行重復測量的方差分析(a=0.05)。
　　 (2)設立對照組(培養(yǎng)基)、實驗組(鼠腎脫細胞基質浸提液)及陽性對照組(含0.64％苯酚溶液的培養(yǎng)基),培養(yǎng)48 h后應

11、用流式細胞技術檢測細胞凋亡情況。
　　 統(tǒng)計方法:實驗結果以平均值士標準差表示((x)±s),采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù),統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析(a=0.05)
　　 研究結果
　　 1.大鼠全腎臟脫細胞基質的制備及灌注過程。
　　 共對20只大鼠完成實驗。開始灌注液流速慢,約10～40滴/min,隨后逐漸加快。更換1％SDS后腎顏色從外至內分段逐漸變白色半透明,120～150min顏色

12、變化逐漸明顯,基本可在肉眼下看清腎內分支狀管脈結構,直至約180～240min腎完全呈均-白色半透明狀,灌注液滴速保持在100～120滴/min,此時測量灌注液總使用量約400～600ml。
　　 2.大鼠全腎臟脫細胞基質的微觀檢測結果。
　　 掃描電鏡觀察結果:對照組可見腎小球及近曲小管等結構完整；實驗組可見腎小體、腎小管周圍的基膜及膠原蛋白等細胞外基質形成網(wǎng)狀結構,其余窄間均為形狀規(guī)則的孔隙,內無細胞。
　　

13、 3.大鼠全腎臟脫細胞支架細胞相容性實驗結果。
　　 (1)第24、72和120小時實驗組吸光度值分別為0.620±0.032、0.957±0.007和1.336±0.011,陰性對照吸光度值分別為0.602±0.017、0.965±0.005和1.347±0.006,與陰性對照組比較無統(tǒng)計學差異(P=0.902>0.05)。L929細胞在實驗組第24,72,120小時相對增殖率分別為102.99％,99.17％,99.18％,

14、脫細胞基質支架在各個時間段(24,72,120小時)的細胞毒性評分為(0-1級),符合生物材料的醫(yī)用標準,說明灌注法制備的大鼠腎脫細胞基質無明顯細胞毒性,對細胞增殖無影響。而陽性對照組的細胞毒性評分為3級或4級。根據(jù)該實驗數(shù)據(jù)繪制細胞生長曲線可看出實驗組和對照組兩條生長曲線幾乎平行,說明實驗組和陰性對照組對細胞生長的影響無顯著差別。
　　 (2)應用L929細胞與大鼠腎脫細胞基質浸提液共培養(yǎng)48h,進行流式細胞儀檢測,與陰性對照