日本沼蝦不同亞型維甲酸類(lèi)X受體(RXR)cDNA克隆及組織表達(dá)分析.pdf

1、維甲酸類(lèi)X受體(RXR)屬于核受體家族中第二亞族成員，在類(lèi)固醇核受體家族中高度保守，首次是從人肝和腎細(xì)胞中的cDNA文庫(kù)中，分離到了人類(lèi)的hRXR。在昆蟲(chóng)和甲殼動(dòng)物中，RXR處于蛻皮、變態(tài)及繁殖等生命過(guò)程的級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)位置，對(duì)完成其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖具有十分重要的作用。日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖蝦類(lèi)品種之一，有著很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)選取日本沼蝦作為研究對(duì)象，分離和克隆了RXR的五種不同

2、異構(gòu)型基因，同時(shí)通過(guò)普通PCR法初步了解了MnRXR在胚胎發(fā)育不同發(fā)育期和不同組織的表達(dá)分布。
　　 1.參照小鼠、斑馬魚(yú)、蟹、水蚤等其他物種的RXR基因具有較高保守性的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，以日本沼蝦卵巢cDNA為模板，通過(guò)簡(jiǎn)并RT-PCR的方法，獲得一條約200bp的條帶，測(cè)序后確定得到的部分cDNA序列是日本沼蝦的RXR基因。以上述所得序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物進(jìn)行普通RT-PCR，以管家基因beta-actin作為陽(yáng)性對(duì)

3、照，研究MnRXR在精巢、卵巢、心臟、肌肉、肝胰腺、胃、鰓、表皮、腸等組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明其在所有組織中均有表達(dá)，在精巢、卵巢和外表皮中表達(dá)量較高。同時(shí)，又用該對(duì)特異引物對(duì)日本沼蝦在胚胎發(fā)育不同時(shí)期MnRXR的表達(dá)分布做了分析，結(jié)果顯示，MnRXR在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，且在后無(wú)節(jié)幼體期和前蚤狀幼體期表達(dá)量達(dá)到最高。
　　 2.根據(jù)獲得的MnRXR部分序列分別設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行5’RACE和3’RACE擴(kuò)增，結(jié)果都分別得

4、到了3種不同的序列，將測(cè)得的序列分別與保守區(qū)序列進(jìn)行序列拼接，最終確定了5種不同的異構(gòu)體形式，比較發(fā)現(xiàn)它們有著高度的同源性，在DBD高度保守區(qū)域都是一致的，主要是在N末端和C末端有所差異。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別在3’ UTR和5’UTR區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行擴(kuò)增并克隆測(cè)序，證實(shí)了得到的所有序列都是完整的一個(gè)分子。經(jīng)核苷酸序列分析，其中開(kāi)放閱讀框最長(zhǎng)的MnRXR12，全長(zhǎng)為1698bp，編碼序列為1011bp，編碼337個(gè)氨基酸，(包括

5、polyA)，5’非編碼區(qū)(5’UTR)核苷酸序列長(zhǎng)度為354bp，3’非編碼區(qū)(3’UTR)333bp，對(duì)MnRXR12所編碼的氨基酸分析表明：其含有RXR核受體家族蛋白所具有的A-F區(qū)域的所有結(jié)構(gòu)，并且與C、D、E區(qū)域和黑背陸地蟹的GlRXRa蛋白有著100％的一致性，進(jìn)一步說(shuō)明克隆的MnRXR確實(shí)是日本沼蝦的RXR基因，且其氨基酸序列高度保守。從N端到C端，可以在MnRXR12的DBD區(qū)找到高度保守的P-box(EGCKG)和D-

6、box(CREER)兩個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，同時(shí)，在鉸鏈域D域也找到了1個(gè)識(shí)別DNA的T-box，在E/F區(qū)域也有1個(gè)β-轉(zhuǎn)角區(qū)域和幾個(gè)a-螺旋(H1-H9)。然而，通過(guò)將日本沼蝦RXRa基因氨基酸序列與其它物種的多重比較發(fā)現(xiàn)，所克隆的日本沼蝦MnRXR12在H9螺旋處發(fā)生了中斷，缺失了H9-H12的功能區(qū)域，推測(cè)日本沼蝦RXR還可能存在其他異構(gòu)體形式。
　　 MnRXR13核苷酸序列全長(zhǎng)為1659bp，編碼326個(gè)氨基酸，5’UTR核苷

7、酸序列長(zhǎng)度為348bp，3’UTR為333bp；MnRXRs1核苷酸序列全長(zhǎng)為1193bp，編碼277個(gè)氨基酸，5’UTR為核苷酸序列長(zhǎng)度為99bp，3’UTR為263bp；MnRXRs2核苷酸序列全長(zhǎng)為1346bp，編碼243個(gè)氨基酸，5’UTR為核苷酸序列長(zhǎng)度為354bp，3’UTR為263bp；MnRXRs3核苷酸序列全長(zhǎng)為1292bp，編碼227個(gè)氨基酸，5’UTR為核苷酸序列長(zhǎng)度為348bp，3’UTR為263bp。對(duì)比5個(gè)不

8、同構(gòu)型的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)日本沼蝦卵巢RXR的cDNA共有四個(gè)不同的剪切位點(diǎn)，一個(gè)發(fā)生在5’端A/B區(qū)，產(chǎn)生了3種不同形式的5’端序列；一個(gè)在RXR受體結(jié)構(gòu)的D區(qū)即鉸鏈區(qū)域，使T-盒區(qū)長(zhǎng)度也有3種形式(+12/+7/+7△5)，兩個(gè)發(fā)生在LBD區(qū)，其中一個(gè)是在H1-H3螺旋區(qū)域，產(chǎn)生了2種不同形式(MnRXRl/MnRXRs)，另外一個(gè)是在D區(qū)產(chǎn)生了中斷，缺失了E/F區(qū)域(MnRXRm)。
　　 3.根據(jù)得到的5個(gè)亞型的全全長(zhǎng)序列

9、，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行普通RT-PCR，研究了各亞型在不同組織及胚胎發(fā)育不同時(shí)期MnRXR的表達(dá)分布情況，結(jié)果顯示，在卵巢組織中及胚胎發(fā)育早期卵裂期所有的亞型均有表達(dá)，且MnRXRs3只在卵巢中特異表達(dá)；在其他組織中，各亞型的表達(dá)分布不盡相同，揭示了不同亞型可能參與了不同的生理功能。
　　 盡管RXR在脊椎動(dòng)物中有廣泛深入的研究，在甲殼動(dòng)物中也有相關(guān)的數(shù)據(jù)，但是在甲殼類(lèi)中，只有在陸地蟹G.lateralis中有眾多的RXR異構(gòu)體形式