延邊黃牛體細(xì)胞克隆電融合的研究.pdf

1、雖然體細(xì)胞核移植技術(shù)在牛的方面已經(jīng)獲得了很大成功，但是提高核移植效率，仍是該技術(shù)研究的長遠(yuǎn)任務(wù)。許多技術(shù)環(huán)節(jié)需要改進(jìn)和完善，其中重組卵母細(xì)胞的卵——核融合在體細(xì)胞核移植技術(shù)中起著重要作用。在核移植中，融合率越高，可供培養(yǎng)的核移植胚胎數(shù)量越多，生產(chǎn)出的可用胚胎數(shù)就多，這樣核移植效率也就越高。可見，重組胚的融合率直接影響著核移植的效率，是核移植技術(shù)成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。試驗(yàn)采用延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞作供核細(xì)胞，MⅡ期去核卵母細(xì)胞作受體細(xì)胞，

2、擠壓法去核，卵周隙內(nèi)注核，電融合的方法對融合液、融合方法以及適宜融合方法的融合條件進(jìn)行研究，探尋適宜延邊黃牛體細(xì)胞克隆的最佳融合條件。試驗(yàn)結(jié)果以融合率、卵裂率和重組胚體外發(fā)育率來評定，結(jié)果如下：
　　1.0.25M、0.28M、0.30M不同濃度蔗糖融合液的融合率、卵裂率差異不顯著；在4-8細(xì)胞胚胎發(fā)育率上0.28M組是最好的，顯著高于0.25M組（51.01％vs32.95%，p<0.05），與0.30M組差異不顯著（40.12

3、%，p>0.05）。
　　2.0.25M、0.28M、0.30M不同濃度D-山梨醇融合液的融合率、卵裂率差異不顯著；在16細(xì)胞胚胎發(fā)育率上0.28M組與0.30M組差異不顯著（20.68% vs17.45%，p>0.05），顯著高于0.25M組（9.25%，p<0.05）。
　　3.0.25M、0.28M、0.30M不同濃度甘露醇融合液在融合率、卵裂率、4-8細(xì)胞胚胎發(fā)育率、16細(xì)胞胚胎發(fā)育率上，以0.28M組的效果最好，分

4、別為89.54%，82.64%，61.29%，23.70%；但三組間的各項(xiàng)差異均不顯著(p>0.05)。
　　4.0.28M蔗糖、D-山梨醇、甘露醇不同融合液對核移植效率的影響。三組的融合率差異不顯著（88.44%vs86.83%vs86.85%，p>0.05）；蔗糖與甘露醇融合液的卵裂率(87.98%vs86.06%)和囊胚發(fā)育率(22.16%vs19.91%)差異不顯著（p>0.05），但顯著高于D-山梨醇融合液（78.64%

5、和10.14%，p<0.05）。
　　5.0.28M蔗糖融合液，融合液濃度梯度融合法的融合率、卵裂率和囊胚發(fā)育率均顯著高于普通融合法（92.98%vs88.55%；91.07%vs80.96%；40.06%vs30.19%，p<0.05）。
　　6.0.28M甘露醇融合液，融合液濃度梯度融合法的融合率、卵裂率和囊胚發(fā)育率均顯著高于普通融合法（91.22%vs84.89%；88.02%vs80.42%；39.51%vs29.1

6、9%，p<0.05）。
　　7.使用1200v/cm融合電場強(qiáng)度的融合率為89.07%與1100v/cm和1300v/cm的87.66%和90.14%差異不顯著(p>0.05)，與1000v/cm的81.83%存在顯著差異（p<0.05）；在卵裂率上1100v/cm和1200v/cm顯著高于1300v/cm（85.07% vs86.47% vs76.96%，p<0.05），與1000v/cm差異不顯著（80.85%，p>0.05）

7、；囊胚發(fā)育率以1200v/cm的29.59%最高，與1100v/cm的28.89%不存在差異（p>0.05），但顯著高于1000v/cm和1300v/cm的19.46%和14.61%（p<0.05）。
　　8.使用2次融合脈沖的融合率、卵裂率和囊胚發(fā)育率分別為88.03%，86.35%和31.63%，是適宜延邊黃牛體細(xì)胞克隆、融合液濃度梯度融合法的最佳脈沖次數(shù)。
　　9.脈沖時(shí)程為40μs的融合率與20μs、80μs差異不顯

8、著（86.10%vs83.30%vs84.60%，p>0.05），顯著高于10μs（79.60%，p<0.05）；20μs，40μs的卵裂率（88.54%，83.61%vs74.21%，65.63%，p>0.05）和囊胚發(fā)育率（32.92%vs30.38%vs20.88%vs19.62%，p>0.05）顯著高于10μs、80μs。
　　結(jié)論：適宜延邊黃牛體細(xì)胞克隆的融合液為0.28M蔗糖融合液。融合液濃度梯度融合法能有效提高延邊黃